【摘 要】
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如今,抗生素作为抑菌药物被广泛应用于我国养殖业,养殖过程中的多种细菌性疾病大多是使用抗生素进行治疗,滥用抗生素的情况也同时存在。随着健康养殖和食品安全越来越受到人们的关注,“减抗,替抗”成为养殖业及相关行业的发展趋势,因此,寻找新的、安全有效的抗生素替代物对养殖行业的发展具有重要意义。而解淀粉芽孢杆菌作为一种益生菌,能够产生多种抗菌活性成分,其产生的抗菌活性成分具有替代抗生素的潜能。本研究从土壤中
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如今,抗生素作为抑菌药物被广泛应用于我国养殖业,养殖过程中的多种细菌性疾病大多是使用抗生素进行治疗,滥用抗生素的情况也同时存在。随着健康养殖和食品安全越来越受到人们的关注,“减抗,替抗”成为养殖业及相关行业的发展趋势,因此,寻找新的、安全有效的抗生素替代物对养殖行业的发展具有重要意义。而解淀粉芽孢杆菌作为一种益生菌,能够产生多种抗菌活性成分,其产生的抗菌活性成分具有替代抗生素的潜能。本研究从土壤中分离得到了一株抗菌效果较好的解淀粉芽孢杆菌B1,对其产抗菌成分的发酵条件进行了优化,并鉴定B1所产的抗菌成分中的脂肽的种类。同时,对B1所产的抗菌成分的稳定性,安全性进行测定,并研究了其抗菌成分防治小鼠大肠杆菌感染的效果,为其实际生产和应用提供了理论基础。本研究从土壤中分离出一株芽孢杆菌B1,对B1的16S r DNA进行扩增,T载体连接扩增片段,并测序鉴定,经鉴定B1为解淀粉芽孢杆菌。采用PCR方法鉴定B1基因组中抗菌脂肽合成的相关基因,结果显示其基因组中具有抗菌脂肽Iturins和Bacillomycin合成的相关基因。并推测其产物中含有Iturin家族抗菌脂肽。对B1产抗菌成分的发酵条件进行优化,在单因素实验基础上采用响应面法优化发酵培养基,按照Box-Behnken设计实验,拟合出实验模型。并确定最优的发酵培养基配方为:麦芽糊精20 g/L,L-谷氨酸钠5 g/L,酵母提取物0.7 g/L,Mg SO4 2.157 g/L,Mn SO4 12.283 mg/L,KH2PO41.0 g/L,Na2HPO40.8 g/L。扩大并尝试了B1的工业化发酵,42 h内发酵活性达15.60 mm,效果良好,为B1的工业化发酵提供了理论基础。采用大孔树脂吸附-乙醇洗脱的方法制备活性成分粗纯品,并确定洗脱用的乙醇最优浓度为70%。采用纯甲醇从固体粗纯品中提取得到活性成分,经薄层层析鉴定其中含有环脂肽。最后采用RP-HPLC对活性成分进一步分离,成功从甲醇提取液中分离并制备出三种抗菌成分p1、p4和p7。经LC-Q-TOF鉴定p1成分为Iturin C,并推测p4为多肽GGVYVHPV,p7为儿茶酚嗜铁素。对活性成分的稳定性、溶血活性和抗菌能力进行测定,结果表明活性成分的耐酸碱、耐酶和耐热稳定性总体较好,无溶血活性,对测定的多种致病菌具有抗菌活性。使用粗纯品进行小鼠攻菌保护实验,结果显示粗纯品的安全性好,同时对感染了致病性大肠杆菌的小鼠具有一定的保护能力,特别是通过口服的方式,但总体保护率偏低。
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