随着现代社会生活节奏逐步加快，工作、生活压力的增加，患有失眠、焦虑等神经系统类疾病的人越来越多，且呈上升趋势。地西泮(diazepam)是苯二氮卓类药物的代表药物，在临床上广泛用于镇静、催眠、抗焦虑、抗癫痫。苯二氮卓类药物的上述中枢作用是通过作用于大脑皮层中特殊的苯二氮卓受体(benzodiazepine receptors，BDZ-Rs)产生的。 研究发现，苯二氮卓受体(BDZ-Rs)可分为中枢型 (centralbenzodiazepine receptors，CBRs) 和外周型 (peripheral benzodiazepine receptors，PBRs)。CBRs为GABA<,A>受体-氯离子通道复合物的一个组成部分，分布在大脑皮层，介导此类药物的镇静、催眠、抗焦虑、抗惊厥及中枢性肌松作用；PBRs最初发现于外周组织中，后发现也表达于中枢神经系统的胶质细胞上，它在免疫细胞上有丰富的表达。 PBR 是由169个氨基酸组成分子量为 18kDa的蛋白质，含有丰富色氨酸，脂溶性很强。PBR 与 32 kDa的电压依赖性离子通道 (voltage-dependent anionchannel，VDAC) 和 30 kDa的腺嘌呤核苷酸载体 (adenine nucleotide carrier，ANC) 形成三聚体，组成了线粒体通透性转移孔道 (mitochondrial permeabilitytransition pore，MPTP)(Figure 1)。此外PBR还与PBR associated protein-1(PRAX-1) 偶联。18 kDa的亚基优先结合异喹啉甲酰胺类化合物，如PK11195；苯二氮卓类药物配体，如R<,o> 5-4864与PBRs的 18 和 32 kDa亚基结合。30kDa亚基在配体结合中不起作用，是腺嘌呤核苷酸的载体<'[12][34]>。 多项研究发现苯二氮卓类药物可能通过作用于免疫细胞上的PBRs影响免疫功能。早在1982年，Descotes等发现地西泮能抑制正常小鼠绵羊红细胞诱导的初级抗体的产生和迟发性超敏反应<'[13]>。地西泮和 Ro 5-4864 能浓度依赖性地抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖<'[14]>；能诱导人单核细胞的趋化作用<'[15]>。巨噬细胞和单核细胞上的PBRs能影响一些炎症因子的分泌<'[16]>。人的单核细胞实验也取得类似的结果<'[17]>，11例做泌尿道内窥镜检查的病人术前麻醉静脉注射咪唑地西泮(0.08 mg/kg)，能显著降低和延迟受试者外周血中单核细胞在LPS刺激下产生IL-1β，TNF-α，IL-6等细胞因子。但研究结果并不一致，Ramseier<'[20]的实验提示在T细胞上可能还存在有别于 PBRs 及 CBRs 的受体。 Miyawaki<'[21]>的研究认为咪唑地西泮抑制 IL-6 的作用不是通过 PBRs，可能通过其它机制发挥作用。 从上述研究背景可看出，苯二氮卓类药物对免疫功能影响的研究较集中于单核细胞和巨噬细胞，对其作用于 T 细胞的研究较少，且结果并不一致；未发现其对NK细胞研究的报道。而 T 细胞介导的细胞免疫及 NK 细胞在机体抗肿瘤、抗感染、免疫调节中有着重要的作用。因此我们利用多种能选择性作用于BDZ-Rs 的药物：地西泮、Ro 5-4864、PK11195、D8555，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和流式细胞术(FCM)研究苯二氮卓类药物对T细胞和NK细胞功能的影响，并深入探讨其作用机制。 地西泮为混合型药物，既能与 CBRs 结合，又能与PBRs结合；Ro5-4864为PBRs的选择性激动剂，PK11195为PBRs的拮抗剂，对PBRs的亲和力比CBRs高约1000倍；D8555能选择性与中枢胶质细胞上PBRs结合<'[26][34]>。 研究结果表明： 1．地西泮呈浓度依赖性地抑制 anti-CD3 诱导 T 细胞产生 IFN-γ(rs=0.93，P<0.01)。台盼蓝拒染法计数表明，PBMCs 经 anti-CD3刺激后细胞数目增加(P<0.01)，高浓度的地西泮组(10<'-5>和10<'-4>M)活细胞数目显著少于 anti-CD3组(P<0.01)，低浓度的地西泮组细胞数目与anti-CD3组相比无明显变化。细胞计数表明各浓度组的死细胞率均小于6％。 2．选择性的PBRs激动剂 Ro 5-4864能显著抑制T细胞产生IFN-γ，其抑制作用要强于D8555，两者抑制作用有显著性差异(P<0.05)。 3．PBRs的选择性拮抗剂PK11195能促进 T 细胞产牛IFN-γ PBMCs 用 anti-CD3 刺激的同时，加入 PK11195 (10<'-5>～10<'-7>M)培养72h，能促进 T 细胞产生 IFN-γ(P<0.01)。 4．PK11195能拮抗 R<,o>5-4864对 T 细胞产生 IFN-γ的抑制作用PBMCs 用 anti-CD3 刺激的同时，加入 Ro 5-4864 (10<'-4> M)，不同浓度的PK11195+R<,o>5-4864 (10<'-4>M) (PK11195与R<,o>5-4864同时加入) 培养72h，R<,o>5-4864抑制 IFN-γ产生的作用未被拮抗。PBMCs 用 anti-CD3刺激的同时，用不同浓度的 PK11195 预处理 4h 后，再加入R<,o>5-4864 (10<'-4>M)，各浓度组的PK11195均能拮抗R<,o>5-4864对PBMCs产生 IFN-γ的抑制作用。 5．PK11195 只能部分拮抗地西泮对 PBMCs 产生IFN-γ的抑制作用PBMCs 用 anti-CD3 刺激的同时，加地西泮(10<'-5>M)，不同浓度的 PK11195+地西泮(10<'-5>M) (PK11195与地西泮同时加入)培养 72h，地西泮抑制IFN-γ产生的作用未能被拮抗。PBMCs 用 anti-CD3刺激的同时，用不同浓度的PK11195预处理4h后，再加入地西泮(10<'-5>M)，结果表明各浓度组的 PK11195只能部分拮抗地西泮对PBMCs产生 IFN-γ的抑制作用。 6．地西泮和 R<,o>5-4864 均能抑制 CD4<'+> 和 CD8<'+> T 淋巴细胞 IFN-γ的表达PBMCs 在 anti-CD3 或 anti-CD3+ 地西泮，anti-CD3+R<,o>5-4864培养24小时后，进行细胞表面分子和胞内因子的染色，用流式细胞仪检测。结果表明，地西泮不仅抑制 CD4<'+> 和 CD8<'+>T 细胞 IFN-γ产生细胞的百分率，同时还抑制IFN-γ的表达密度。Anti-CD3 刺激 PBMCs 24h后，0.67％CD4<'+>T 和 17.01％的 CD8<'+>T表达IFN-γ，加入R<,o> 5-4864 (10<'-4>M)后，只有0.26％CD4<'+>T 细胞和 7.64％的 CD8<'+>T 细胞表达 IFN-γ，抑制率分别为 61.2％和 55.1％；加入地西泮 (10<'-5>M)，表达 IFN-γ的 CD4<'+>T 和 CD8<'+>T细胞的比例分别由对照组的 5.24％下降到 2.74％， 15.33％下降到 6.73％，抑制率分别为 47.7％和56.1％。 7．地西泮抑制 NK 淋巴细胞产生 IFN-γ PBMCs 用IL-12刺激的同时，加入不同浓度的地西泮培养72h。IL-12能刺敫正常人PBMCs产生大量的IFN-γ，地西泮 (10<'-5>～10<'-8>M) 对IL-12所诱导的 IFN-γ均有抑制作用(P<0.01)。 8．地西泮抑制CD3<'->CD56<'+>NK细胞IFN-γ的表达PBMCs用IL-12或IL-12+地西泮培养24小时后，进行细胞表面分子和胞内因子的染色，用流式细胞仪检测。结果表明，地西泮不仅抑制CD3<'->CD56<'+>NK 细胞 IFN-γ产生细胞的百分率，同时还抑制 IFN-γ的表达密度。 IL-12刺激PBMCs 24h后，7.11％的CD3<'->CD56<'+> NK 细胞产生 IFN-γ，加入地西泮(10<'-5>M) 共培养组，只有1.89％的 CD3<'->CD56<'+>NK 产生 IFN-γ，抑制率为73.4％。 结论： 地西泮可部分通过作用于T细胞及NK细胞上的PBRs抑制 IFN-γ的产生。