[目的]建立小鼠结肠炎模型,在整体、组织、细胞、分子水平探索小檗碱对结肠炎治疗作用的机制,为开发小檗碱作为治疗结肠炎使用的新用途提供实验依据。[方法]1实验动物模型的建立建模分两个阶段,第一个阶段是葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)诱导结肠炎阶段,第二个阶段是小檗碱治疗阶段,不同的实验组在两个阶段有不同的处理。将C57雄性小鼠按体重和性别随机分为4组,分别为不做任何处理的空白对照组、小檗碱低剂量组和高剂量组、模型组。除了空白对照组外,其他三组均饲喂2%DSS,第五天撤掉DSS。低、高剂量实验组在第6天分别给药50mg/kg、100mg/kg小檗碱,连续给药三天。监测并记录小鼠的体重、溏便、便血等变化。2组织HE染色评价建模第10天取结肠组织,并用10%中性福尔马林固定组织,石蜡包埋机包埋,切片机进行切片,经过脱蜡、水化处理,再进行HE染色,荧光显微镜下拍照观察,并对HE染色结果进行打分。3小檗碱对肠道菌群的影响建模第8天分别取各组小鼠的粪便,用无菌PBS溶解成三个质量浓度梯度(10、1、0.1 mg/mL),每个梯度涂3个板子,每个板子涂板600μL粪便菌液,37℃烘箱过夜培养,第2天观察并计数菌落数量,分析小檗碱对结肠炎小鼠粪便菌落数的影响。4流式细胞术分析小鼠结肠炎性细胞的比例分别取3组(不包括低剂量给药组)小鼠第10天的结肠组织,分离结肠固有层单核细胞,标记两组流式抗体,避光,冰上放置30 min,再用含3%血清的1640培养基洗掉抗体,最后用2%多聚甲醛固定,暂时放4℃冰箱避光保存。将固定好的细胞转移到流式上样管中检测。5q-pcr检测结肠组织中炎性因子的表达分别取4组小鼠第10天的结肠组织,于液氮中研磨至粉末,然后在超净台中加入trizol和氯仿,分层取水相,加入等体积异丙醇离心得到rna沉淀,75%乙醇洗沉淀,最后用无rna酶的水溶解沉淀即得rna,-80℃保存。提取的rna经dna酶消化去除dna后,70℃金属浴处理10min,反转录获得cdna,然后进行q-pcr,用iq5软件分析数据。[结果]1建模过程中小鼠的变化1.1体重变化趋势建模过程中每天测量记录小鼠体重,发现后期饲喂小檗碱的实验组小鼠体重逐渐恢复,且高剂量小檗碱实验组比低剂量实验组体重恢复效果更好,而未给药小檗碱的实验组小鼠体重持续下降,小鼠状态较差。1.2粪便粘稠度变化模型组小鼠随着肠炎的加重,粪便形态由最开始的正常粪便逐渐变为不成形的溏便;低、高剂量给药小檗碱的实验组小鼠在诱导肠炎阶段,粪便逐渐变松散,而在小檗碱治疗阶段粪便形态慢慢恢复至接近正常,而且高剂量给药小檗碱组比低剂量给药小檗碱的实验组小鼠便溏恢复效果更好。空白对照组小鼠粪便形状无变化。1.3肛门出血变化模型组小鼠随着肠炎的加重,肛门处由隐匿性出血逐渐变为肉眼可见的出血;中、高剂量给药小檗碱的实验组小鼠在诱导肠炎阶段肛门处逐渐出现肉眼可见的出血,而在小檗碱治疗阶段出血情况恢复好转,且高剂量给药小檗碱的实验组小鼠比低剂量给药小檗碱的实验组小鼠肛门出血恢复效果更好,不做任何处理的空白对照组小鼠无肛门出血情况出现。1.4结肠形态变化模型组小鼠结肠变粗变短,而低、高剂量给药小檗碱实验组小鼠在治疗后结肠形态恢复接近至正常,而且高剂量给药小檗碱实验组比低剂量给药小檗碱实验组小鼠结肠恢复效果更好。2组织HE染色变化空白对照组结肠组织形态完好,结构分层明显,无损伤,未见炎症反应;模型组小鼠结肠组织损伤严重,黏膜层基本结构遭到破坏,杯状细胞大量缺失,固有层淋巴细胞浸润明显,黏膜肌层可见组织水肿和充血;低、高剂量给药组小鼠结肠组织损伤程度减轻,组织结构层次分明,固有层炎性细胞浸润减少,杯状细胞数量相对增多,黏膜肌层未见组织水肿和充血,组织形态已明显恢复。3小檗碱对肠道菌群的影响空白对照组菌落数很少,仅为104个数量级;给小檗碱后的小鼠粪便中菌落数明显减少(P<0.01),抑制损伤后肠道菌群的繁殖,从而发挥保护功能。4流式细胞术分析小鼠结肠炎性细胞的比例在单核细胞比例方面,低剂量给药组和模型组小鼠结肠无明显差异;而在中性粒细胞方面,低剂量给药组比模型组比例明显降低,推测小檗碱抑制结肠炎的主要机制可能是通过抑制了中性粒细胞迁移和聚集来实现的。5 Q-PCR检测结肠组织中炎性因子的表达低、高剂量给药组小鼠结肠促修复因子TGF-β表达升高,而促炎因子TNF-α、IL-23表达降低,使得肠炎得以恢复。[结论]小檗碱对DSS诱导的结肠炎具有保护作用。小檗碱能够减轻结肠炎引起的体重下降、便溏和便血,使结肠形态恢复正常,组织损伤得到改善,炎性细胞中性粒细胞比例下降,炎性因子表达减少,修复因子表达增多,同时抑制肠道致病菌的入侵,最终使结肠炎得以治愈。