【研究背景】胃癌在全世界范围内属于高发肿瘤,其死亡人数位居恶性肿瘤的第二位。其中约90%的病例组织学分型为胃腺癌。胃癌也是我国最常见的恶性肿瘤之一,在我国其发病率居各类肿瘤的首位。阐明胃癌发生发展的分子机制对于改进现有的治疗措施具有积极意义。胃癌的发生发展与胃粘膜慢性炎症高度相关。在幽门螺杆菌感染基础上继发的胃粘膜慢性炎症是胃癌发生的重要病理基础。大量炎性介质在胃粘膜炎症局部长期积聚,可能为胃癌的发生提供了合适的微环境。COX-2催化生成前列腺素,是介导机体炎症反应的重要分子。近年来的研究发现,COX-2与肿瘤的关系也非常密切。COX-2在多种肿瘤组织中高表达;抑制COX-2表达可降低肿瘤细胞的增殖和促血管生成能力。在多数胃癌组织及胃癌细胞系中,COX-2异常高表达,可促进胃癌侵袭转移及血管形成。而降低COX-2表达则可抑制胃癌细胞增殖,抑制血管形成,使细胞凋亡增加。15-PGDH催化降解前列腺素,在体内发挥与COX-2相拮抗的功能,是负调控炎症反应的关键分子。近年来人们发现15-PGDH与肿瘤也有密切关系,是一个潜在的抑癌基因。15-PGDH在肺癌,乳腺癌,甲状腺癌,结肠癌等恶性肿瘤中低表达。第四军医大学肿瘤生物学国家重点实验室,西京医院消化内科刘震雄博士等研究发现,在胃癌组织中,COX-2蛋白水平与15-PGDH负相关;在SGC-7901胃癌细胞中,COX-2可下调15-PGDH表达;15-PGDH在胃癌组织中低表达,其水平与肿瘤恶性程度负相关。但是在COX-2调控15-PGDH表达的机制方面尚未进行深入研究。本论文涉及的研究内容是在此基础上展开的,期望有助于阐明COX-2经由15-PGDH调控胃癌细胞生物学特性的分子机制。FOXA2,又名HNF3β,是广泛分布于肝,肺,骨骼肌等组织的转录因子,在肺癌组织中FOXA2能直接结合于15-PGDH启动子区域,上调15-PGDH表达水平。但FOXA2在胃癌中发挥的作用尚未见报道。因此我们在胃癌中对FOXA2表达情况,及其调控15-PGDH表达的可能机制进行了研究。DNA的甲基化/去甲基化过程是脊椎动物基因表达调控的重要环节,几乎所有在人体内广泛表达的蛋白质均受到甲基化/去甲基化机制的调控。抑癌基因的过甲基化是肿瘤发生的重要机制之一。因此我们考虑探讨COX-2是否可能通过升高FOXA2启动子区域甲基化水平,抑制FOXA2 mRNA转录,进而调控FOXA2和15-PGDH的表达。【研究结果】1 COX-2在不同分化程度胃癌细胞中均能负调控15-PGDH表达在MKN-28,AGS,SGC-7901及MKN-45胃癌细胞系中,高表达COX-2均能抑制15-PGDH表达,在人永生化胃粘膜上皮细胞系GES-1中也获得了相似的结果;在不同分化程度的胃癌细胞及GES-1细胞中干涉COX-2表达则能上调15-PGDH表达水平;LPS诱导产生的内源性COX-2也能显著抑制SGC-7901细胞中15-PGDH表达;与之相反,COX-2选择性抑制剂Celecoxib显著上调SGC-7901细胞中15-PGDH表达水平。COX-2在胃癌细胞中对15-PGDH的抑制效应得到进一步证实。2 COX-2通过降低FOXA2水平抑制胃癌细胞中15-PGDH表达不同分化程度的胃癌细胞系及永生化胃粘膜上皮细胞中均有FOXA2表达,高分化胃癌细胞中FOXA2表达量较高;胃溃疡粘膜及高分化胃癌组织中FOXA2表达强于低分化胃癌组织(p<0.05),TNM I期和II期患者胃癌组织中FOXA2表达强于TNM III期和IV期患者胃癌组织(p<0.05),胃癌恶性程度越高,其中FOXA2表达水平越低;在SGC-7901细胞中,过表达COX-2或LPS诱导生成的COX-2均能使SGC-7901细胞中FOXA2 mRNA及蛋白水平降低,而干涉COX-2或抑制COX-2活性均能提高SGC-7901细胞中FOXA2 mRNA及蛋白水平。在稳定转染COX-2的SGC-7901-COX2细胞中,15-PGDH蛋白表达被抑制,给予SGC-7901-COX2细胞以外源性的FOXA2可以抵消COX-2对15-PGDH表达的抑制效应,并降低SGC-7901-COX2细胞的PGE2分泌量,提高SGC-7901-COX2细胞凋亡率;与之相反,在低表达COX-2的SGC-7901-COX2shRNA细胞中,15-PGDH蛋白水平较高,干涉SGC-7901细胞中的FOXA2可以使15-PGDH蛋白水平下降,并升高SGC-7901-COX2shRNA细胞的PGE2分泌量,降低SGC-7901-COX2shRNA细胞凋亡率;COX-2对15-PGDH表达的下调效应须由FOXA2介导。FOXA2可激活SGC-7901细胞中pGL3-PGDH报告基因的表达,但是当COX-2高表达时,FOXA2对pGL3-PGDH报告基因的激活受到限制;COX-2抑制胃癌细胞中FOXA2与15-PGDH启动子区域的结合,部分阻断了15-PGDH的转录起始过程。胃癌细胞中,COX-2通过抑制FOXA2 mRNA转录,下调FOXA2表达,低水平的FOXA2继而导致依赖FOXA2转录因子活性的15-PGDH转录起始过程受抑制,15-PGDH表达量也随之下降。3 COX-2通过增强FOXA2启动子CpG岛甲基化抑制FOXA2表达不同分化程度的胃癌细胞(MKN-28,SGC-7901及原代低分化胃腺癌细胞)中FOXA2启动子CpG区域甲基化比例均高于癌旁组织细胞及永生化胃粘膜上皮细胞;过表达COX-2或用LPS诱导内源性COX-2时,FOXA2启动子CpG岛甲基化比例高于COX-2低表达状态,干涉COX-2或抑制COX-2活性时FOXA2启动子CpG区域甲基化比例低于COX-2高表达状态,COX-2促进SGC-7901细胞中FOXA2启动子CpG岛甲基化。DNA甲基转移酶抑制剂提高COX-2高表达SGC-7901细胞中FOXA2和15-PGDH表达水平,5-Az作用下,COX-2对FOXA2和15-PGDH表达的抑制效应减弱,COX-2对FOXA2表达的抑制需要甲基化过程的参与;5-Az可提高COX-2高表达SGC-7901-COX2细胞中FOXA2 mRNA水平,COX-2可能通过促甲基化机制,抑制FOXA2基因启动子形成转录起始复合物,从而降低FOXA2表达。【研究结论】1在胃癌细胞中,COX-2可提高FOXA2基因启动子CpG岛甲基化水平,进而间接抑制FOXA2 mRNA转录,降低FOXA2表达水平。2 COX-2通过降低胃癌细胞中FOXA2表达水平,抑制15-PGDH表达。3 FOXA2在胃癌中发挥类似抑癌基因的功能。