双氧木脂素A诱导白纹伊蚊的转录组差异分析

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双氧木脂素A(haedoxan A,HA)是从多年生草本植物透骨草(Phryma leptostachya L.)中分离鉴定的一种二氧双环辛烷木脂素类化合物,HA对多种害虫有效,尤其对家蝇和蚊子幼虫具有较高的杀虫活性。前期的症状学观察表明,供试昆虫经HA处理后肌肉松弛、虫体不自主震颤、出现麻醉现象并最终死亡,根据处理昆虫的中毒症状推测HA可能作用于昆虫的神经元或肌肉受体,但其具体的药物作用机制和靶标尚不清楚。基于高通量转录组测序技术,使得从生物体的转录层面筛选药物及其相关作用机制成为可能。因此,本研究利用Illumina高通量测序技术对HA亚致死剂量处理24 h后白纹伊蚊三龄幼虫和未处理的照组进行了转录组测序,从生物信息学角度分析了HA诱导下白纹伊蚊的差异表达基因,并就HA显著作用的神经节鞘糖脂生物合成途径进行了分析和验证,为进一步探索HA的作用机理提供了一定的参考依据。主要结果如下:1、双氧木脂素A(HA)对白纹伊蚊3龄幼虫的毒力测定表明,HA对白纹伊蚊杀虫活性高,LC50为0.31μg/mL,从而选择亚致死剂量诱导浓度LC30为0.2μg/mL。2、进行转录组测序,测序结果共产生了139734078原始数据(Raw Reads),原始数据经过严格的数据过滤和质量评估后,共产生了137375042有效数据(Clean Reads),将测序所得原始数据提交到NCBI的SRA数据库,登录号:SRP190133。3、将产生的Clean Reads与NCBI上白纹伊蚊参考基因组序列进行比对,我们以|Log2(FoldChange)|>1且qvalue<0.005作为筛选标准共鉴定出416个差异基因,其中有328个基因表达上调,88个基因表达下调。GO功能显著性富集分析表明差异基因主要富集在“蛋白水解”、“碳水化合物代谢过程”、“转运活性”、“底物特异性转运蛋白活性”和“胰蛋白酶活性”五个生物功能中。KEGG代谢通路分析将136个差异基因汇集到47条KEGG代谢通路,差异基因主要富集在“神经节鞘糖脂的生物合成”、“糖胺聚糖和其他聚糖降解”、“叶酸参与的一碳代谢”、“泛酸和CoA生物合成”四个代谢通路。4、利用qRT-PCR检测了从转录组差异基因中筛选出的10个差异基因的相对表达量,其结果与测序结果基本一致,表明转录组测序结果可靠。5、差异基因主要富集在神经节鞘糖脂的生物合成通路,推测HA处理白纹伊蚊后鞘糖脂中神经节苷脂的生物合成受到显著影响,从而通过阻断细胞间通讯,对昆虫产生神经毒性;对神经节苷脂生物合成途径中关键酶β-半乳糖苷酶(GLB1)的酶活性测定初步验证了这一推测,这些结果为进一步研究HA如何作用并调控神经节鞘糖脂的生物合成途径、导致昆虫神经性中毒机理的研究提供了一定的参考依据。
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