芽孢杆菌高产抗菌脂肽的菌株筛选体系建立及其诱变育种研究

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我国是水产养殖大国,但是随着养殖业的迅速发展和高密度集约化的增大,养殖病害频繁发生,养殖过程中抗生素滥用,导致细菌耐药性现象不断出现,寻找一种安全有效的抗生素替代物成为当务之急。芽孢杆菌能够产生多种抗菌物质,其抑菌机理与传统抗生素具有本质区别,不易产生耐药性,并且具有广谱的杀菌作用,将芽孢杆菌抗菌脂肽应用于水产养殖,不仅能够抵制水产致病菌的攻击,还能对水产动物的健康起到益生作用,提高其生长性能。为了改变野生菌株普遍存在的低产量现象,本研究对抗菌脂肽产生菌进行了出发菌株筛选、鉴定、发酵优化、筛选体系建立、诱变育种等研究,主要研究结果如下:(1)对实验室前期保存的一些芽孢杆菌进行抑菌活性筛选,挑选出两株抑菌效果最好的菌株P1和P6作为初始菌株,对两株初始菌株进行了形态特征、生理生化特征鉴定,结合分子生物学鉴定结果,将其归类为解淀粉芽孢杆菌。(2)对菌株发酵产脂肽的培养基和培养条件进行了优化,确定最终的培养条件为:培养基采用MSM培养基(蔗糖20 g,NH4NO3 2 g,KH2PO4 3 g,Na2HPO4 10 g,MgSO40.2 g,酵母膏0.2 g,CaCl2 0.7μg,MnSO4 1μg,一级水1 L),最佳培养条件为温度30℃,培养基pH天然,装液量80 mL,培养时间60 h,转速220 r/min,接种量5%,在最佳发酵条件下抑菌圈直径达到22mm,比优化前提高了51.7%。(3)对发酵液的温度耐受性、酸碱耐受性、紫外照射耐受性以及不同提取方法进行了研究,结果表明发酵液经100℃处理30 min后残留活性仍有84.76%,p H耐受范围为39,经紫外照射3 h后抑菌活性仍保持在50%以上。抑菌谱实验结果表明,发酵液对15种水产致病菌均具有抑制作用甚至杀菌作用。(4)以提高脂肽产量为目标,对初始菌株P1和P6进行紫外诱变育种,筛选出4个菌株,这些诱变菌株的总脂肽含量分别提高了66.3%,92%,5.2%和31%。对P1和其突变株P1-120-15进行荧光定量PCR检测目标基因的表达量,结果表明突变株的sfp基因、ituD基因和fen A基因的表达量分别为原始菌株的1.19倍、1.09倍和1.11倍,结果无显著差异(p>0.05)。(5)研究了传统的脂肽产生菌筛选方法和建立在颜色反应基础上的高通量筛选方法,发现传统脂肽产生菌筛选方法具有通量低、不灵敏等缺点;探究了两种高通量筛选抗菌脂肽高产菌株的筛选方法,即CPC-BTB筛选体系和BTB筛选体系,BTB筛选体系结果更加准确、稳定性好,且操作简便,更适合用于产脂肽芽孢杆菌的筛选。
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