妊娠肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是一种妊娠期特发的肝脏疾病,主要发生于妊娠中晚期,以皮肤瘙痒、血清胆酸升高、肝功轻至中度异常为主要特点.ICP的确切病因目前尚不清楚.近年来,大量流行病学及实验研究表明雌激素在ICP中起重要作用.由于雌激素在ICP中起重要作用,地塞米松能减少胎儿肾上腺脱氢表雄酮(dehydroepiadrosterone DHEA)的分泌,降低雌激素的产生,减轻胆汁淤积.地塞米松亦有促进胎儿肺成熟的作用.因此地塞米松是目前治疗ICP的主要选择药物之一.但地塞米松治疗存在副作用.近年来,在糖皮质激素治疗早产儿肺成熟的动物实验和临床研究结果表明,产前重复使用糖皮质激素有抑制胎儿生长,延缓神经髓鞘的形成,新生儿败血症增高等不良影响.糖皮质激素的主要副作用是影响肾上腺功能,体内肾上腺功能受下丘脑-垂体的调控.地塞米松治疗ICP比单纯用于促进早产儿肺成熟的治疗剂量大,疗程更长.目前地塞米松治疗ICP是否对胎儿垂体、肾上腺功能存在影响及影响程度尚不明确.为研究地塞米松治疗ICP对胎儿垂体、肾上腺功能的影响,该实验通过建立ICP大鼠动物模型,通过地塞米松治疗后,采用放射免疫、免疫组化测定胎鼠血浆皮质醇、ACTH及垂体ACTH的表达和垂体、肾上腺组织结构的变化,部分ICP患者脐带血清皮质醇、ACTH的变化,探讨地塞米松在治疗ICP中对胎儿垂体、肾上腺功能的影响.第一部分ICP胎鼠血清皮质醇及垂体ACTH变化 一、ICP大鼠动物模型的建立 (一)材料与方法 1. 动物准备和药物处理 Wistar雌性大鼠20只,随机分成EE组和对照组(N组),EE组于妊娠15天起皮下注射EE-丙二醇溶液,2.5mg/kg/天,连续5天.N组注射等量丙二醇溶液.2. 标本采集 两组孕鼠均于见到阴道血性分泌物后剖宫产,取下腔静脉血,分离血清,-20℃保存.记录胎鼠数量、体重、妊娠天数.取孕鼠肝左叶分别置于10﹪福尔马林、3.5﹪重铬酸钾-甲醛水溶液和4﹪多聚甲醛固定.3. 实验方法 全自动生化分析仪测定大鼠肝功能,放免法测定血清胆酸.HE和硝酸银染色及透射电镜制作按常规进行,分别观察肝小叶结构、胆小管管径和肝细胞超微结构改变.4. 统计学分析 结果采用SPSS 10.0软件进行t检验和χ<2>检验.P<0.05为相差显著.(二)结果 EE组大鼠血清ALP、ALT和胆酸水平较N组显著升高(P<0.05,P<0.01),胎鼠体重和妊娠天数降低,死产率增加,与N组相比有显著差异(P<0.001);电镜下见EE组大鼠胆小管显著扩张,微绒毛减少甚至消失.(三)讨论 本实验结果显示,EE组孕鼠出现血清胆酸和肝酶ALP、ALT升高,以胆酸升高较显著,这与ICP患者的血清生化改变一致.ALP属于胆淤指示酶,大部分吸附于胆小管细胞膜缘和窦状隙表面,胆汁淤积时,胆汁酸凭借其表面活性作用可将肝细胞内ALP从脂性膜上渗析出来,故ALP可早于其它肝功指标的异常.AST较对照组有升高趋势,但统计学处理无显著性差异,可能与样本量大小有关.HE染色见EE组大鼠肝细胞排列稍紊乱,偶见点状坏死;银染见胆小管无明显扩张,说明孕鼠肝脏损害较轻微,符合ICP患者的肝脏病理特点.电镜下发现,EE组孕鼠胆小管显著扩张,重者呈囊状,微绒毛数量减少或消失,管腔内见退变的膜性结构.EE组胎鼠妊娠天数和体重下降、死产率增加也与ICP患者相似,但程度更甚于后者.小结:EE可建立稳定的大鼠ICP动物模型,所测血清生化指标和超微结构改变与ICP相符,可用于ICP的试验研究.二ICP地塞米松治疗后胎鼠ACTH及皮质醇浓度测定 (一) 材料与方法 1.实验动物 妊娠15天Wistar大鼠40只,随机数字法分成4组:A组(ICP组)、B组(ICP地塞米松治疗组)、C组(正常妊娠地塞米松注射组)及D组(正常妊娠组). 2.标本采集 4组孕鼠均于见到阴道血性分泌物剖宫终止妊娠.胎鼠活体以断头方法取血,分离血浆后-20℃保存.取活体胎鼠垂体、肾上腺置于4﹪多聚甲醛固定,部分组织4﹪甲醛溶液固定.A组、B组取大鼠静脉血,分离血清后-20℃保存.记录胎鼠数量、体重、妊娠天数等一般资料.3.实验方法 全自动生化分析仪测定A、B组大鼠肝功能,放免法测定血清肝胆酸.免疫组化测定胎鼠垂体ACTH表达,放免法测定胎鼠血ACTH、皮质醇水平.HE及透射电镜制作按常规进行,分别观察胎鼠垂体、肾上腺结构和细胞超微结构改变.4.统计学分析 结果采用SPSS 10.0软件进行t检验和χ2检验.P<0.05为相差显著.(二)结果 A组(ICP组)血清ALT、ALP和肝胆酸均明显高于B组(ICP地塞米松治疗组)(P<0.01).各组胎鼠垂体ACTH均为阳性表达,A组(ICP组)与D组(正常妊娠组)免疫组化表达IOD值无差异(P>0.05);B组与C组(正常妊娠地塞米松注射组)比较无差异(P>0.05);A组和D组较B组和C组表达高(P<0.01).胎鼠血浆ACTH、皮质醇水平:A组与D组无差异(P>0.05),均较B组和C组高(P<0.01),B、C两组间无差异(P>0.05).(三)讨论 雌激素在ICP中起重要作用,妊娠期间的雌激素主要来自胎儿—胎盘单位,胎儿肾上腺脱氢表雄酮(DHEA)是胎盘产生雌激素的前身物质,地塞米松能通过胎盘抑制胎儿肾上腺DHEA的分泌,从而降低血中雌激素水平,以减轻胆汁淤积的病理变化;且地塞米松兼有促进胎肺成熟的作用.但多种动物实验表明,糖皮质激素抑制胎儿生长,使胎仔动物出生体重明显减轻;影响胎仔动物beta-细胞的发育和延缓神经髓鞘的形成等副作用.糖皮质激素的主要副作用是对免疫系统的抑制,造成机体对感染的抵抗能力降低.Erdeljan等发现糖皮质激素降低鼠海马神经元糖皮质激素受体的表达,对盐皮质激素受体的表达无影响.Dean等的研究有类似结论,且对动物胎仔的影响程度有性别差异.在猪模型的研究中发现,产前重复使用糖皮质激素抑制胎仔下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素释放激素受体的表达.本组实验资料中,大鼠ICP动物模型通过地塞米松治疗后孕鼠肝功血清学指标改善,血清胆酸浓度明显降低,胎鼠死胎、死产率明显降低.表明地塞米松确能减轻ICP的症状,改善胎儿的预后.但ICP地塞米松治疗组和正常妊娠地塞米松注射组胎鼠垂体免疫组化ACTH 表达较正常对照组减弱,胎鼠血浆ACTH浓度降低,皮质醇浓度降低,这与Banks等的研究结果相似.McCabe等则报道,在猪模型的研究中发现,产前重复使用糖皮质激素抑制胎仔下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素释放激素受体的表达.这可能与动物种类、用药孕期及剂量有关,结果仍需进一步研究证明.第二部分ICP患者地塞米松治疗后脐带血清ACTH、皮质醇测定 (一)材料与方法 1.临床资料 2002年5月至2002年11月在该院明确诊断为ICP且使用地塞米松治疗的孕妇24例为观察组,对照组为同期住院、未使用地塞米松治疗的孕妇26例.均于正式临产前行剖宫产术.2.标本采集 ICP患者地塞米松治疗前后行瘙痒症状评分;抽静脉血5ml,分离血清,-20℃冷冻保存,用于检测肝功生化指标,胆酸水平;两组分娩取脐带血5ml,分离血清,-20℃冷冻保存,用于测定ACTH及皮质醇水平.3.实验方法 ACTH、皮质醇水平采用放免法测定.4.统计分析 所得数据采用SPSS 10.0软件进行t检验和χ<2>检验.P<0.05为差异显著.(二)结果ICP组地塞米松治疗后瘙痒症状评分明显降低(P<0.01);血清胆酸水平明显降低(P<0.01);肝功能检查ALT、ALP治疗后降低显著(P<0.01),AST、TBiL无明显变化(P>0.05).地塞米松治疗后ICP组脐带血清ACTH和皮质醇浓度均较对照组降低(P<0.01).(三)讨论 本研究资料中,ICP患者给予地塞米松治疗后,皮肤瘙痒症状明显减轻,肝功能检测ALT、ALP治疗后降低显著,血清胆酸水平明显降低.提示地塞米松能有效改善ICP的临床症状.ICP组新生儿窒息率较对照组无差异,可能与样本量小,入选病例孕周及地塞米松治疗有关.糖皮质激素的主要副作用是对免疫系统的抑制,造成机体对感染的抵抗能力降低.不少临床研究发现,糖皮质激素在感染情况下不仅不能改善胎儿肺部疾病,还有可能降低抗生素的效果,导致感染加重,甚至显著增加新生儿败血症的发生.本组实验资料中,ICP地塞米松治疗组脐血中皮质醇及ACTH浓度较对照组明显降低.这与Banks等研究结果一致.有报道在鼠和猪动物模型的研究中发现产前应用地塞米松抑制胎仔动物下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素受体的表达.这可能与动物种类、用药孕期及剂量有关,结果仍需进一步研究证明.地塞米松对胎儿垂体-肾上腺远期功能是否存在影响以及程度,有待进一步研究.另外,地塞米松对ICP的治疗评价及最佳的治疗剂量、疗程有待进一步的临床研究.结论:1.EE可建立稳定的大鼠ICP动物模型,动物出现血清生化改变和胆酸水平升高,电镜下病变肝脏可见胆小管扩张、线粒体变性.2.地塞米松治疗ICP动物模型,胎仔血清皮质醇、ACTH浓度降低;地塞米松治疗ICP患者,胎儿脐带血清皮质醇、ACTH浓度降低.3.地塞米松治疗ICP可能对胎儿垂体-肾上腺功能存在近期影响,是否存在远期影响以及程度,有待进一步研究.地塞米松对ICP的治疗评价及最佳的治疗剂量、疗程有待进一步的临床研究.