论文部分内容阅读
奥沙利铂为第三代金属铂类化疗药物,临床应用广泛。奥沙利铂所致的急、慢性周围神经毒性为其临床常见的不良反应之一,引起广泛的关注和研究。中药温经通络散(主要组成为：川乌、老鹳草、红花、桂枝等,治则：活血化瘀、温经通络)。本课题组前期一项十一五多中心、随机、对照临床研究选取奥沙利铂化疗后出现周围神经毒性患者102例,其中试验组68例、对照组34例,分别给予温经通络散外用(洗／浸)治疗或安慰剂外用(洗/浸),观察周期为7天。结果显示,试验组与对照组治疗前后的NRS评分相比,组间差异有统计学意义P<0.05；试验组疼痛缓解有效率较对照组升高,P<0.05；周围神经毒性疗效总有效率试验组较对照组升高,P<0.01。本研究在前期临床研究和动物实验研究基础之上,进一步探讨温经通络散外用治疗奥沙利铂周围神经毒性可能的作用机制,及其对奥沙利铂抗肿瘤作用的影响。为温经通络散外用治疗奥沙利铂周围神经毒性提供科学依据。目的：1.研究温经通络散外用对于皮下移植瘤小鼠模型在给予奥沙利铂化疗过程中,对肿瘤体积、质量的影响。2.研究中药温经通络散外用对奥沙利铂周围神经毒性模型大鼠行为学的影响,并观察其对大鼠背根神经节神经元的影响,及其对脊髓、背根神经节参与的神经病理性疼痛信号传导的干预作用。方法：1.皮下移植瘤小鼠模型实验：雄性BALB/c小鼠随机分为对照组、奥沙利铂组、奥沙利铂+中药组各6只,每只小鼠分别予皮下注射约2×106个小鼠结肠癌细胞,以制造小鼠皮下移植瘤模型。奥沙利铂组与奥沙利铂+中药组小鼠予腹腔注射奥沙利铂6mg/kg,每周2次,连续2周,对照组小鼠腹腔注射等体积5%葡萄糖。奥沙利铂+中药组小鼠予温经通络散浸泡四肢及尾部,20min,每日2次。奥沙利铂组予去离子水作为对照,定期观察小鼠腹腔注射奥沙利铂后行为学改变及中药外用对行为学的改善作用。分别测量观测对照组、奥沙利铂组、奥沙利铂+中药组小鼠肿瘤体积、质量。2.奥沙利铂周围神经毒性大鼠模型实验：雌性wistar大鼠2批共36只,通过随机数字表随机分为对照组、模型组、中药组各6只。模型组与中药组大鼠予腹腔注射奥沙利铂4mg/kg,每周2次,连续4周(分别于第1、2、8、9、15、16、22、23天注射),建立奥沙利铂周围神经毒性大鼠模型,对照组大鼠腹腔注射等体积5%葡萄糖。造模第8天开始,将温经通络散浸剂加入1%月桂氮酮,浸泡中药组大鼠四肢和尾部,每日2次,每次20min,浸泡后对大鼠四肢尾部进行清水擦洗,共计给药23天；给药时采用自制容器,以保证大鼠四肢及尾部完全浸没于中药药液。模型组仅予去离水加入1%月桂氮酮浸泡大鼠四肢和尾部进行对照。检测指标：(1)定期观测各组大鼠行为学改变,包括机械性刺激感觉过敏、超敏反应、冷刺激过敏反应(2)神经电生理学检测大鼠尾神经感觉神经传导速度(3)血浆NGF含量分析(4)石蜡切片,HE染色观察背根神经节形态学变化、采用TUNEL染色观察背根神经节神经细胞的凋亡、免疫组化法分析脊髓背角GFAP表达水平。(5)采用RT-PCR法观察大鼠背根神经节GLT1(谷氨酸转运体1)和GLAST(谷氨酸/天冬氨酸转运体)以及TRPA1(辣椒素受体1)的表达。结果：皮下移植瘤小鼠模型实验研究发现,第11、15天,奥沙利铂组、奥沙利铂+中药组小鼠肿瘤体积明显小于对照组,(P<0.05、P<0.01),奥沙利铂+中药组较奥沙利铂组相比肿瘤体积无明显差异(P>0.05)。第15天,肿瘤质量比较发现,奥沙利铂组、奥沙利铂+中药组瘤体质量较对照组明显降低(P<0.01),奥沙利铂+中药组肿瘤体积较奥沙利铂组体积相比无统计学差异(P>0.05)。奥沙利铂周围神经毒性大鼠模型实验研究发现,模型组大鼠较对照组相比出现明显行为学改变,表现为4g和15g Von Frey纤维、冷刺激后缩足次数明显增多,尾神经感觉神感觉经传导速度(SNCV)、血浆NGF下降(P<0.05),背根神经节神经元核仁固缩明显,偏心核、多核仁核增多(P<0.05)。中药组大鼠行为学明显改善；尾神经SNCV及血浆NGF较模型组均升高(P<0.05)。TUNEL染色模型组较对照组相比,背根神经节神经元细胞缩小,胞核深染,凋亡率明显增加,中药组较模型组相比,神经元凋亡率明显降低。脊髓GFAP染色发现,模型组脊髓背角星形胶质细胞胞体增大,突起增多变粗,呈深染,与对照组相比有显著差异(P<0.01),中药组与模型组相比,阳性细胞减少,突起减少(P<0.01)。RT-PCR结果显示,模型组大鼠背根神经节内GTT-1、GLAST均呈现出明显下降的特点,较对照组相比差异明显(P<0.05),而中药组大鼠GTT-1、 GLAST与对照组无明显差别,较模型组相比显著升高(P<0.01)。模型组大鼠背根神经节内TRPA1较对照组相比明显升高(P<0.05),而中药组较模型组明显降低(P<0.01)。结论：1.温经通络散外用可治疗奥沙利铂周围神经毒性,且不影响奥沙利铂抗肿瘤疗效。2.外用中药温经通络散可显著改善奥沙利铂所致周围神经毒性大鼠冷温度和机械刺激下的行为学改变。其机制第一,可能提高NGF水平促进周围神经修复进而提高尾神经SNCV有关。第二,可能与维持背根神经节内兴奋性氨基酸转运体水平进而抑制背根神经节神经元的凋亡、同时抑制脊髓背角星形胶质细胞活化所介导的神经病理性疼痛有关。第三,可能与抑制冷受体介导的机械性及冷温度刺激过敏反应有关。