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目的:栀子(Gardenia jasminoides Ellis)是茜草科栀子属植物栀子的干燥果实,属于药食两用资源,具有保肝利胆、降血压、止血、清热解毒等作用。它的化学成分十分复杂,包括有环烯醚萜类、黄酮类、有机酸酯类、醇类、多糖类、长链烷烃类和醛类等主要化合物,而目前研究利用最多的是环烯醚萜苷类和黄色素。2015版药典规定栀子的有效成分为桅子苷,与京尼平苷同属环烯醚萜苷类,药理研究表明它们具有抗肿瘤、保肝、抗抑郁与止血等功效。抗肿瘤、抗抑郁一直都是研究的热点,然而发挥药效作用的化学成分从植物中的获取量较低,因此阐明药用植物次生代谢产物的合成途径以及调控手段显得十分重要。目前对栀子的研究集中在化学成分分离、药理活性和临床应用等,对其次生代谢产物的合成途径及调控的研究尚少。为了阐明栀子中环烯醚萜苷类的生物合成途径,本文选取环烯醚萜生物合成途径中的关键酶基因-10羟基香叶醇氧化还原酶(10-Hydroxygeraniol oxidoreductase,10-HGO)作为研究对象,对其进行基因克隆和生化功能分析。方法:从桅子转录组中对10-HGO基因进行筛选。通过蛋白序列比对和系统进化树的构建来分析其序列结构;并设计特异引物,使用实时荧光定量PCR技术对其转录组表达水平进行分析,使用普通PCR技术对其基因组结构进行分析。设计特异引物克隆10-HGO基因,并构建到pMAL-C5X原核表达载体上,通过大肠杆菌表达系统和MBP标签(麦芽糖融合蛋白)纯化系统来进行蛋白的表达与纯化。将纯化后的蛋白作用于 10-Hydroxygeraniol、10-Oxogeraniol、Geraiol、P-coumaraldehyde、Sinapylaldehyde、Coniferylaldehyde等底物,催化产物利用气相色谱-质谱联用仪(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)和超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC)来检测和分析,并利用酶标仪进行酶动力学实验。随后通过定点突变技术获得突变体,同样对突变体进行蛋白表达与纯化,并进行定量分析,研究突变体生化功能的变化。最后利用分子建模,找出10-HGO基因的关键氨基酸残基。结果:本文一共筛选得到了三个栀子10-HGO候选基因,分别命名为Gj 10-HGO1、Gj10-HGO2、Gj10-HG03。蛋白序列结果显示,三个Gj10-HGO基因与HGO家族、香叶醇脱氢酶(GEDH)家族、肉桂醇脱氢酶(CAD)家族等基因的相似度高达80%以上,并具有NADP/NADPH和Zn2+结合位点等保守结构域。系统进化树显示,三个Gj10-HGO基因与HGO家族聚为一类,并与GEDH家族同源性很高。对其进行荧光定量PCR实验结果显示,Gj10-HGO1在果实和下部叶片的表达量较高,Gj10-HGO2在花中的表达量最高,而Gj10-HGO3在下部叶片中的表达量最高。基因组结构分析显示,Gj10-HGO1基因的全长为2229 bp;Gj10-HGO2基因的全长为1786 bp;Gj10-HGO3基因的全长为2334 bp;这三个基因均含有4个内含子和5和外显子。随后,克隆得到了三个Gj10-HGO基因的编码序列,并构建至pMAL-C5X载体上。将重组质粒转化至大肠杆菌中诱导表达,纯化得到蛋白。生化功能分析结果显示,三个 Gj10-HGO 基因所编码的蛋白均对 10-Hydroxygeraniol、10-Oxogeraniol、Geraiol、P-coumaraldehyde、Sinapylaldehyde、Coniferylaldehyde 等底物有活性。酶动力学结果显示,Gj10-HGO1 对 Geraniol 的活性最高;Gj10-HGO2 对 10-Hydroxygeraniol;Gj10-HGO3 对 P-coumaraldehyde 的活性最高。通过定点突变得到了 7个突变体,并顺利分别得到其蛋白。生化功能和定量分析结果显示,除了G250Y突变体以外,其余的六个突变体对10-Hydroxygeraniol、10-Oxogeraniol、Geraiol、P-coumaraldehyde、Sinapylaldehyde、Coniferylaldehyde 等底物的生化活性变化不大,而G250Y突变体则完全丧失生化功能。随后,分子建模得到了 Gj10-HGO1,G250Y突变体,YA100VG突变体和V190L突变体的蛋白模型。通过结构比较,找到了 43-47,LYS,VAL,LEU,TYR,CYS;328-329,ILE,PRO;351-352,ILE,ASP等可能的关键氨基酸残基。结论:本文克隆并鉴定了三个Gj10-HGO基因,发现它们均具有三类酶基因的功能,分别是HGO,GEDH和CAD。综合上述分析,认为Gj10-HGO1最有可能参与栀子环烯醚萜苷类的生物合成途径。通过定点突变,获得一个功能完全丧失的突变体,从而通过分子模拟结构比较,找到了一些关键氨基酸残基。这些为栀子环烯醚萜苷类生物的合成途径填补了一块空白,也为10-HGO基因生化功能的解析提供了依据。