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目的:通过细胞培养制备纯度较高的MSCs和完善更加科学的中药提取方法;制备SD大鼠短暂性脑缺血再灌注损伤(I/R)模型。通过对实验模型灌胃制备的益气活血方和经动脉移植MSCs后,应用RT-PCR和电泳的方法检测短暂性脑缺血再灌注损伤病灶组织碱性成纤维生长因子(BasicFibroblastGrowthFactor,bFGF)mRNA的表达。来评价益气活血方联合动脉移植MSCs对脑缺血损伤的作用,来探讨益气活血方和MSCs移植促进碱性成纤维生长因子在短暂性脑缺血再灌注损伤中的作用机制。 方法:清洁级成年健康SD大鼠,无菌条件下取出股骨和胫骨,DMEM培养液冲出骨髓,目钢网过滤。然后用密度梯度离心法分离获取骨髓单个核细胞(mononuclearcells,MNCs),PBS洗两次,将沉淀物加入含％FBS的DMEM培养液ml,轻轻吹打,做成细胞悬液,计数,稀释,按设计密度接种于T-75培养瓶中,置于℃、体积分数为%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中原代培养。待细胞铺满瓶底后用%胰蛋白酶消化传代,取第七代冻存移植。 采用“线栓法”制备SD大鼠短暂性脑缺血再灌注损伤模型,模型分为空白组、对照组、MSCs移植治疗组和益气活血方联合MSCs移植治疗组,每组只。在造模缺血小时再灌注天后,取各组造模成功的不同给药:益气活血方联合MSCs移植治疗组和MSCs移植治疗组经颈动脉注入MSCs悬液,空白组、对照组经颈动脉注入等量生理盐水。脑缺血模型空白组、对照组和MSCs移植组分别灌胃生理盐水(ml/kg体重),联合组按同等的相应药量灌服益气活血汤药。各组在造模前天开始给药,每日一次,连用天。结束后断头取脑,取缺血再灌注损伤病灶处脑组织放入液氮中-80℃保存。 应用分子生物学技术通过RT-PCR方法:用TRIzol法从组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。检测bFGF在短暂脑缺血再灌注损伤的表达。结合运用现代图像软件处理技术并对密度扫描分析以反映bFGFmRNA相对水平,观察各组的bFGF表达情况。 结果: 1.益气活血方联合MSCs移植治疗组(n=8),表达水平为(4.38±.32),和空白组(n=7,.04±.27)相比显著增高,差异有统计学意义(P=0.02,P＜0.05); 2.对照组(n=8,.17±.34)与益气活血方联合MSCs移植治疗组与相比,差异有统计学意义(P＜0.05),MSCs移植治疗组(n=7,.92±.77)与对照组相比有统计学意义(P＜0.05); 3.益气活血方联合MSCs移植治疗组bFGF表达高于MSCs移植治疗组,脑缺血对照组的变化与空白组相似,同一时间点相比较,均显著低于MSCs移植治疗组。益气活血方联合MSCs移植治疗组bFGF高表达;空白组和对照组SD大鼠脑组织仅有bFGF轻微表达,相比差异无显著性(P＞0.05)。 结论: 1.采用密度梯度离心法能够去除骨髓中的绝大多数红细胞、脂肪细胞和血小板,分离获取单核细胞,经原代培养和不断的传代获取纯度较高的MSCs。 2.应用药物分析化学的方法对益气活血汤药分别提取芳香水,减压浓缩制备。方法更先进,有效成分不易丢失,提高了药物的生物利用度,更有利于吸收;降低了灌胃量,不适反应大大减少。 3.短暂性脑缺血再灌注损伤动物模型的制备采用改良线栓法取得了较好效果,神经行为学评分理想,症状很接近人表现。其简便、易行,容易操作,很具有实用性,是制作脑缺血再灌注损伤动物模型理想的方法。 4.应用RT-PCR和电泳检测是可行有效的方法,证明了益气活血方和MSCs移植治疗短暂性脑缺血再灌注损伤可能通过诱发促进脑内bFGF的高水平表达,激活内源性神经保护机制,使它在保护病灶周围神经元、促进细胞增殖和组织修复中可能发挥着重要作用。中药联合MSCs移植可对脑缺血再灌注损伤起保护作用,促内源性bFGF表达可能是其机制之一。 5.通过中药的应用和外源性MSCs移植治疗脑缺血再灌注损伤后的机制是整体协同作用,为中药联合干细胞的临床应用奠定药理学基础。此不仅为今后本病的临床应用提供科学依据,而且为同类研究提供了一条新的思路,具有一定的前瞻性和科学、学术价值。