论文部分内容阅读
乳腺癌是仅次于肺癌的全球第二大常见癌症,其发病率居女性恶性肿瘤的首位。目前治疗乳腺癌的手段多为手术、放化疗等,但极易复发与转移及全身系统毒副作用造成其预后效果不佳,探索新型安全有效的治疗新策略以抑制其复发与转移仍是基础及临床研究面临的重大挑战。声动力疗法（sonodynamictherapy,SDT）作为一种新兴的肿瘤治疗手段,主要是利用超声激活声敏剂产生活性氧（ROS）等杀伤肿瘤细胞。声敏剂是影响SDT抗肿瘤效果的关键因素,卟啉、卟吩类衍生物等作为声敏剂开展了诸多抗肿瘤的基础研究。紫红素18是一种卟啉类衍生物,具有良好的声光活性,实验室前期已经制备出紫红素18膜嵌合的卟啉脂质体,初步显示其能够作为声光刺激响应型可控药物释放载体。血管新生是实体肿瘤复发与转移的重要原因,通过抑制肿瘤血管生成有望成为极具潜力的乳腺癌治疗新策略。盐酸安罗替尼（Anlotinib hydrochloride,AL）,是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂,能够通过抑制血管内皮细胞生长因子（VEGF）等来阻断肿瘤新生血管的生成,进而抑制肿瘤生长。基于此,本论文设计合成了一种载AL的靶向紫红素18脂质体（iRGD-Plipo-AL）,经超声处理,一方面促使所负载AL的局部定点释放,达到肿瘤细胞损伤和抑制肿瘤血管生成的作用;另一方面脂质体膜上嵌合的声敏剂紫红素18响应超声刺激,产生声动力效应杀伤肿瘤细胞,由SDT联合AL的靶向性声化疗作用高效抑制了乳腺癌生长与转移。具体实验研究如下:第一部分iRGD-Plipo-AL制备、表征及其超声释药性能的评估采用薄膜水化法制备iRGD-Plipo-AL,选择紫红素18脂质体作为包载抗肿瘤血管新生抑制剂AL的装载平台,将AL装载在脂质体亲水内核中。利用动态光散射法测定iRGD-Plipo-AL的粒径和电位,透射电子显微镜观察iRGD-Plipo-AL颗粒形貌,高效液相色谱法测定iRGD-Plipo-AL的包封率和载药量。同时,为了考察iRGD-Plipo-AL的稳定性,在体外连续7天对其粒径和多分散系数（PDI）进行测定。通过对苯二甲酸法检测超声刺激紫红素18产生自由基情况。实验结果显示:薄膜水化法制备iRGD-Plipo-AL的操作步骤简单、稳定性好;透射电子显微镜观察到脂质体呈球状囊泡、单一分散,动态光散射法测得iRGD-Plipo-AL粒径大约为130 nm左右;AL在iRGD-Plipo-AL中的载药量为0.86%,包封率为43%,并且在一定时间内保持相对稳定;此外,iRGD-Plipo-AL的电位与空白脂质体相比没有明显差异,iRGD-Plipo-AL在超声刺激下能够产生ROS,表明研究制备的iRGD-Plipo-AL具有良好的声敏特性。为进一步探讨iRGD-Plipo-AL超声响应性释药,实验采用不同强度的超声处理iRGD-Plipo-AL,利用透析法和高效液相色谱测定AL的释放情况。结果显示,超声处理促进了 AL从iRGD-Plipo-AL释放,且随着超声强度的增加,药物释放率明显增加。第二部分iRGD-Plipo-AL联合超声介导体外抗肿瘤效应研究研究选用小鼠乳腺癌4T1、人乳腺癌MBA-MB-231和MCF-7为细胞模型,采用流式细胞仪和荧光显微镜观察4T1细胞和正常细胞NIH3T3对iRGD修饰脂质体的摄取差异;通过MTT和Calcein-AM/PI双染实验检测不同处理后三种不同乳腺癌细胞的存活率变化;采用AnnexinV/PI检测不同处理后细胞的凋亡情况;通过流式细胞仪结合DCFH-DA探针研究处理后胞内活性氧的生成。结果显示,乳腺癌4T1细胞比正常细胞NIH-3T3更易摄取iRGD靶向的Plipo,并且相较于Plipo,iRGD-Plipo在4T1细胞的摄取量更高。AL对三种不同的乳腺癌细胞均呈现出剂量依赖性杀伤效果,当AL浓度为1 μg/mL时,单独超声和AL没有明显的细胞毒性,单独iRGD-Plipo-AL处理后细胞存活率下降了大约10.86%,而iRGD-Plipo-AL联合2 W/cm2超声处理后后,细胞存活率下降至43.64%（p<0.01）。AnnexinV/PI结果亦显示相较于各单处理组,iRGD-Plipo-AL联合超声能介导更多细胞发生凋亡。流式细胞仪测量DCF荧光强度显示,iRGD-Plipo-AL联合超声能够产生ROS。第三部分iRGD-Plipo-AL联合超声对新生血管生成效应影响体外采用免疫荧光法观察iRGD-Plipo-AL+US对4T1细胞VEGF表达的影响,此外通过免疫组织化学法检测不同处理后肿瘤组织切片中血管内皮生长因子受体VEGFR和血小板内皮粘附分子CD31的表达情况。结果表明,对照组肿瘤细胞VEGF免疫荧光显色较强,iRGD-Plipo-AL+US处理后几乎观察不到VEGF荧光,说明VEGF的表达变弱;组化结果显示出CD31/VEGFR标记的微血管强阳性染色明显减弱,iRGD-Plipo-AL+US处理后,阳性染色几近消失,说明CD31/VEGFR表达量下降,血管形成被有效抑制。第四部分iRGD-Plipo-AL联合超声对体内抗肿瘤效应研究选用雌性Balb/c小鼠作为动物模型,皮下接种4T1细胞,利用活体成像仪检测肿瘤内药物富集,分别通过瘤体积和瘤重、组织切片形态学观察、免疫组化分析、小鼠体重及血清生化指标检测等方面综合分析iRGD-Plipo-AL+US的抗肿瘤效应及毒副作用。结果显示,与Plipo相比,iRGD-Plipo能够在12 h时在体内达到最大富集量,iRGD-Plipo-AL+US处理组对肿瘤的抑制效果较为明显,并且在一定程度上也抑制了乳腺癌的肺转移。通过小鼠体重、血清生化指标和主要脏器切片观察提示本实验处理具有一定的安全性。综上所述,论文设计合成了一种载盐酸安罗替尼的靶向紫红素18脂质体（iRGD-Plipo-AL）并将其应用于声化疗协同抗肿瘤研究。研究发现,iRGD-Plipo-AL能够实现超声控释并且从AL介导的肿瘤血管新生抑制和紫红素1 8介导的声动力两个方面协同增强抗肿瘤效应。论文所开发的治疗手段及获得的实验结果能够为之后超声结合血管抑制相关方面的研究提供一定的理论基础和参考。