背景与目的多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种常见于中老年人的浆细胞恶性增殖性疾病,其发病率在常见的血液系统恶性肿瘤中排第二位。我国的MM发病高峰年龄段为65～74岁,近年来发病率逐年上升,越来越多的医疗科研工作者投入到MM的研究和防治中。肿瘤转移和复发是晚期MM患者死亡的主要原因之一,也是MM临床治疗的难题。有研究表明肿瘤血管的异常生成在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）是外周血单核细胞浸润到肿瘤组织中演变形成的巨噬细胞,是肿瘤基质细胞的重要组成部分。TAMs的浸润与肿瘤细胞的增殖、迁移、耐药和肿瘤血管生成密切相关,TAMs主要分为经典活化的M1型TAMs和替代性活化的M2型TAMs两种亚型。通常认为,M1型TAMs具有促进炎症反应和抗肿瘤的作用,M2型TAMs具有促进肿瘤发生发展的作用,参与血管生成、癌细胞转移等过程。因此,探究不同亚型TAMs在MM移植瘤生长中的作用对于研究TAMs对MM患者的影响具有重要的意义。去除巨噬细胞是研究其在体内发挥功能的重要方法,氯磷酸盐脂质体是一种高效的巨噬细胞清除剂,近年来被广泛应用于肿瘤研究中。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）家族蛋白有VEGFA、VEGFB、VEGFC等多种亚型,其中VEGFA与血管生成关系最为紧密,它能促进血管内皮细胞的增殖和转移,进而调控血管生成。有报道指出单纯的敲低MM细胞中VEGFA的表达并不能显著减少血管的生成,因此我们推测肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中的其它细胞或因子也参与并显著影响了血管生成过程。我们先前的体外实验结果表明,M1型和M2型TAMs在血管生成过程中具有相反的作用,MM细胞和M2型TAMs能协同促进肿瘤血管生成。相较于体外实验,能否在生理生化环境复杂的动物模型体内得出相似的结论尚未可知。本研究旨在探究清除TAMs的同时沉默VEGFA的表达以及分别回输不同亚型TAMs对MM裸鼠移植瘤生长和血管生成的影响,以期为MM的治疗提供新的方法,为临床抑制MM等恶性肿瘤的浸润、转移,改善肿瘤患者的疗效和预后提供理论基础和实验依据。研究方法1.M1/M2型TAMs体外诱导及鉴定将RAW264.7细胞在含有100ng/mL LPS和50ng/mL IFN-γ的完全培养基中培养48 h获得M1型TAMs,在含50ng/mL IL-4的完全培养基中培养48 h获得M2型TAMs。免疫细胞化学方法检测诱导后TAMs表面标志物CD16/CD32（标记M1型TAMs）和CD163蛋白表达（标记M2型TAMs）情况。2.筛选VEGFA siRNA序列构建3条VEGFA siRNA序列,用这些序列转染MM细胞系RPMI8226细胞,采用qRT-PCR检测并筛选出沉默效果最好的干扰序列以备后续实验。3.构建MM裸鼠移植瘤模型及鉴定将在对数生长期的RPMI8226细胞用PBS∶基质胶（1∶1）混合液重悬后注射到Balb/c裸鼠的肩背部皮下,观察记录肿瘤的体积变化情况,当皮下肿瘤体积达100 mm3时可认为荷瘤成功。采用免疫组织化学法检测MM鉴定指标CD38、CD138、Kappa、Lambda的表达以鉴定MM移植瘤。4.清除TAMs和沉默VEGFA表达对MM移植瘤生长和血管生成的影响共有30只裸鼠荷瘤成功,随机选择15只荷瘤成功的裸鼠平均分为3组,分别为NC-1组、Clo组和Clo+si组。NC-1组:尾静脉和瘤内同时注射生理盐水;Clo组:尾静脉注射氯磷酸盐脂质体的同时向瘤内注射生理盐水;Clo+si组:尾静脉注射氯磷酸盐脂质体的同时向瘤内注射VEGFA siRNA转染复合物。给药频率:2次/w;给药时长为2w。5.回输不同亚型TAMs对MM移植瘤生长和血管生成的影响将剩下的15只荷瘤成功的裸鼠随机平均分为3组,分别为NC-2组、Clo+M1组和Clo+M2组。NC-2组:尾静脉注射氯磷酸盐脂质体2w后尾静脉回输生理盐水;Clo+M1组:尾静脉注射氯磷酸盐脂质体2w后尾静脉回输M1型TAMs;Clo+M2组:尾静脉注射氯磷酸盐脂质体2w后尾静脉回输M2型TAMs。给药频率:2次/w;给药时长:尾静脉注射氯磷酸盐脂质体共2w,回输生理盐水及巨噬细胞共2w。6.检测各组相关指标（1）采用免疫组织化学法检测各组裸鼠移植瘤组织中CD38、CD138、Kappa、Lambda、CD31（标记血管）、CD163（标记M2型TAMs）、VEGFA蛋白表达。（2）采用qRT-PCR检测各组裸鼠移植瘤组织中VEGFA m RNA的水平。（3）采用Western Blot检测各组裸鼠移植瘤组织中VEGFA蛋白的表达水平。（4）采用ELISA检测各组裸鼠血清中VEGFA蛋白的表达水平。7.统计学分析实验相关数据使用SPSS 21.0软件进行分析,以均数±标准差（X±S）来表示,使用LSD检验来计算样品间的差异,检验水准α=0.05。所有实验均独立进行3次。研究结果1.成功诱导M1型和M2型TAMs。其中M1型TAMs表现为CD16/CD32阳性表达,CD163阴性表达;M2型TAMs表现为CD163阳性表达,CD16/CD32阴性表达。2.成功筛选出沉默效果最好的siRNA序列。与对照组相比,3条VEGFA siRNA序列均能有效沉默VEGFA的基因表达,其中S1转染细胞后沉默效果最为显著（P<0.01）,故将S1应用于后续实验中。3.成功构建MM裸鼠皮下移植瘤模型。免疫组化结果发现CD38、CD138和Kappa均呈现阳性表达,Lambda表达为阴性,可证实成功构建MM裸鼠皮下移植瘤模型。4.清除TAMs和沉默VEGFA表达对MM移植瘤生长影响的实验中,处死裸鼠获取瘤体并测量瘤体体积和重量。结果显示,与NC-1组相比,Clo组和Clo+si组均能显著抑制瘤体的生长（P<0.01）,其中Clo+si组抑制肿瘤生长效果最为显著。Clo组和Clo+si组的瘤重抑瘤率分别为45.58%和78.28%。5.清除TAMs和沉默VEGFA表达对MM移植瘤血管生成影响的实验中,处死裸鼠并获取瘤体后,免疫组化检测血管生成和M2型TAMs浸润情况。结果显示,与NC-1组相比,Clo组和Clo+si组均能显著抑制血管的生成（P<0.01）并减少M2型TAMs浸润数量（P<0.01）,值得一提的是,Clo+si组抑制血管生成（P<0.01）和M2型TAMs浸润（P<0.05）的效果最为显著。6.清除TAMs和沉默VEGFA表达对MM移植瘤血管生成影响的实验中,处死裸鼠并获取瘤体后,免疫组化、qRT-PCR、Western Blot和ELISA方法检测VEGFA表达情况。qRT-PCR结果显示,NC-1组组织中VEGFA m RNA表达水平显著高于Clo组（P<0.01）和Clo+si组（P<0.01）,并且Clo组表达水平高于Clo+si组（P<0.05）。免疫组化、Western Blot和ELISA方法检测VEGFA蛋白表达水平也呈现出相同的趋势（P<0.05）。7.回输不同亚型巨噬细胞对MM移植瘤生长影响的实验中,处死裸鼠并获取瘤体后,对瘤体体积和重量进行测量。结果显示,与NC-2组相比,Clo+M1组瘤体的生长被显著抑制（P<0.05）,Clo+M2组瘤体的生长被显著促进（P<0.01）。Clo+M1组的瘤重抑瘤率为65.29%。8.回输不同亚型巨噬细胞对MM移植瘤血管生成影响的实验中,处死裸鼠并获取瘤体后,免疫组化检测血管生成和M2型TAMs浸润情况。结果显示,与NC-2组相比,Clo+M1组血管生成被抑制（P<0.05）,Clo+M2组血管生成被显著促进（P<0.01）。M2性TAMs浸润数量有Clo+M2>NC-2>Clo+M1（P<0.05）,值得一提的是,与NC-2组相比,Clo+M1组M2型TAMs浸润被抑制,我们认为大量存在的M1型TAMs通过分泌细胞因子改变TME从而抑制M2型TAMs的浸润。9.回输不同亚型巨噬细胞对MM移植瘤生长和血管生成影响的实验中,处死裸鼠并获取瘤体后,免疫组化、qRT-PCR、Western Blot和ELISA方法检测VEGFA表达情况。qRT-PCR结果显示,NC-2组组织中VEGFA m RNA表达水平显著高于Clo+M1组（P<0.01）,但低于Clo+M2组（P<0.01）。免疫组化、Western Blot和ELISA方法检测VEGFA蛋白表达水平也呈现出相同的趋势（P<0.05）。结论1.清除巨噬细胞及同时沉默瘤体内VEGFA的表达可显著抑制MM裸鼠移植瘤生长和血管生成。2.M1型TAMs能抑制MM裸鼠移植瘤生长及肿瘤血管生成,M2型TAMs能促进裸鼠MM移植瘤生长及肿瘤血管生成。