禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的以气囊炎、关节滑膜炎、输卵管炎和腹膜炎为主要特征的传染病。禽致病性大肠杆菌常与其它病原混合感染或继发感染,从而加重病情,对养禽业造成了严重的经济损失。分泌系统可将细菌蛋白转运到细菌表面,或释放至细菌外环境中,或直接注入宿主细胞内,与细菌的生存及致病性密切相关。ⅥⅥ型分泌系统(Type VI secretion system, T6SS)的装置和噬菌体的结构很相似,存在于超过1/4的细菌中。研究表明,T6SS在不同细菌中发挥不同作用,包括促进细菌毒力、抑制细菌的复制及调节菌间关系等。在很多致病性大肠杆菌中存在完整的T6SS编码基因簇,目前在APEC中发现3个T6SS基因簇,分别为T6SS1、T6SS2、T6SS3。然而,APEC中T6SS核心组分的功能研究甚少,具体作用尚不清楚。研究表明,外界环境的特定信号能够调控T6SS的表达,例如摄铁调节蛋白是细菌铁依赖基因表达的关键调节因子,其可以直接调控某些条件性病原菌T6SS的表达,如EAEC和爱德华菌。另外,双组分系统也可调控T6SS的表达及功能,如沙门菌与铜绿假单胞菌SsrB双组分系统负调控T6SS,因此在细菌感染后期才能检测到T6SS的分泌蛋白。T6SS作为新近发现的蛋白分泌系统,VgrG作为T6SS核心组分,即是结构蛋白又是分泌蛋白,对T6SS的结构及功能至关重要。本研究克隆表达T6SS核心组分VgrG、分析vgrG基因缺失株的生物学特性、双组分系统cpxR基因缺失株的生物学特性及对T6SS表达水平的影响,为进一步研究APEC致病作用奠定基础。1.禽致病性大肠杆菌T6SS2核心组分VgrG克隆表达根据APEC DE719 T6SS2毒力岛vgrG基因序列,设计合成克隆表达引物,以APEC DE719菌株基因组为模板,扩增vgrG基因。通过双酶切定向克隆于原核表达载体pET30a中,构建原核表达载体pET30a-vgrG。然后将重组质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)中,构建相应的表达菌株BL21-pET30a-vgrG。经过1.0mM IPTG诱导后可表达分子量为73 kDa的融合蛋白,进一步通过SDS-PAGE分析表明融合蛋白位于包涵体中。纯化蛋白后免疫新西兰大白兔,获得免疫血清,经过ELISA鉴定具有良好的特异性。2.禽致病性大肠杆菌T6SS2 vgrG基因突变株、互补株构建及其特性分析为研究T6SS2核心组分VgrG在APEC致病过程中的作用,本研究利用Red同源重组系统构建DE719的vgrG基因缺失株,并通过低拷贝质粒pSTV28构建vgrG缺失互补株。通过系列生物学特性试验比较分析野生株、缺失株与互补株的生长特性、运动性、生物被膜形成能力、黏附侵袭能力、动物致病力等差异。结果发现vgrG基因缺失株和互补株有较好的遗传稳定性,且二者的生长速度和运动能力与野生株相比没有明显差异,提示vgrG基因与APEC的生长繁殖和运动性无关。另外,T6SS2核心组分VgrG不影响DE719生物被膜的形成。细胞黏附试验结果显示,vgrG基因缺失株对DF-1细胞的黏附能力增强。致病性试验表明缺失VgrG导致APEC的体内定殖能力及致病力显著下降,在APEC感染过程中发挥重要作用,为了解APEC的致病作用提供参考。3.禽致病性大肠杆菌cpxR基因缺失株、互补株构建及其特性分析本研究利用Red同源重组系统构建DE719的cpxR基因缺失株,并通过低拷贝质粒pSTV28构建cpxR缺失互补株。通过一系列试验分析比较野生株、cpxR基因缺失株及cpxR基因互补株的生物学特性、致病力、T6SS2基因表达水平,探讨cpxR基因对APEC致病性的影响。结果发现cpxR基因缺失株和互补株有较好的遗传稳定性,且其生长速度、运动能力和生物被膜形成能力与野生株相比没有明显差异,提示cpxR与APEC的生长繁殖、运动性和生物被膜形成能力无关。血清杀菌试验结果表明,cpxR基因缺失株的抗血清杀菌能力明显低于野生株。感染试验结果显示,cpxR缺失导致APEC对DF-1细胞的黏附能力及动物致病力显著下降。荧光定量PCR结果显示cpxR基因缺失株的T6SS2效应因子vgrG、hcp1、hcp2的表达水平下调,可能与APEC的致病力及生存有关。