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草莓是一种经济价值很高的果品,但果实采后极易软化腐烂,不耐贮运,造成很大的经济损失。乙烯受体FaEtr2基因在草莓果实成熟阶段大量表达,可能与果实的成熟密切相关。深入研究FaEtr2基因功能将有助于揭示乙烯受体与非跃变型果实成熟的关系,从而为采用生物技术手段提高草莓果实的贮运性能奠定基础。为此,本研究以全明星草莓基因组DNA为模板,PCR扩增到了草莓乙烯受体FaEtr2基因片段,构建了该基因的反义和RNA干扰植物表达载体。以全明星草莓组培苗叶片为试材,研究了基本培养基、激素配比、外植体生理状态、苗龄、暗培养时间等,对草莓不定芽再生的影响,优化了草莓再生条件,获得了草莓高效再生体系。通过叶盘与农杆菌共培养的方法建立了全明星草莓的遗传转化体系,获得了Kanamycin抗性植株。Gus化学组织染色和PCR检测分析表明FaEtr2-RNAi基因已转入全明星草莓植株。主要结果如下:(一)全明星草莓FaEtr2基因克隆及表达载体构建⑴根据已发表的Chandlar草莓乙烯受体FaEtr2的保守氨基酸序列,设计了一对特异性引物,PCR扩增得到一个长1049bp的基因片段,序列分析表明该片段与GenBank中Chandlar草莓FaEtr2基因核苷酸序列及所编码的氨基酸序列同源性高达100%,无内含子序列。说明克隆到的片段是全明星草莓FaEtr2基因片段。⑵将克隆到的全明星草莓FaEtr2核苷酸序列反向克隆到了pBI221质粒的XbaⅠ-BamHⅠ酶切位点之间,构建成中间表达载体pBI221-anti-Etr2。用BamHⅠ和HindⅢ酶切构建好的中间载体pBI221-anti-Etr2和pBI121质粒,切下中间载体质粒上的CaMV 35S启动子和FaEtr2的反义序列,将其定向插入到切除CaMV 35S启动子的pBI121质粒中,构建成反义表达载体pBI121-anti- Etr2。⑶将FaEtr2的序列正向插入到中间载体pBI221质粒的BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点之间,构建成中间表达载体pBI221-sense-Etr2。用EcoRⅠ和HindⅢ酶切构建好的反义表达载体pBI121-anti- Etr2和中间载体pBI221-sense-Etr2。切下中间载体质粒上的GusA、NOS终止子和正义序列,将其插入到切除了GusA和NOS终止子的pBI121-anti-Etr2质粒中,构建成RNAi植物表达载体pBI121- Etr2-RNAi。⑷利用冻融法将pBI121-anti-Etr2、pBI121-Etr2-RNAi两个表达载体转化到农杆菌LBA4404中,经特异性引物对转化菌液的PCR扩增,证实表达载体已转入农杆菌。(二)叶片再生体系的建立⑴对所试的三种基本培养基,MS(1 /2N)、MS和1/2MS,MS(1 /2N)基本培养基最好,分化率可达75.76 %。30天和35天叶龄的叶片外植体分化率高,分别为58.62 %和58.86 %。以幼嫩叶片为外植体,分化率和平均不定芽位点数分别为35.71%和0.46,显著高于老叶片处理(分化率和平均不定芽位点数分别为19.23%和0.23),二者的玻璃化率差异不显著。⑵随着TDZ浓度的升高,叶片分化率、平均不定芽位点数都呈上升趋势,同时玻璃化率也呈上升趋势。TDZ 1.0 mg·L-1和1.5 mg·L-1处理叶片分化率(分别为32.98%和36.67%)、平均不定芽位点数(分别为0.42和0.47)均较高,但TDZ 1.5mg·L-1处理的玻璃化率显著高于TDZ 1.0 mg·L-1处理。综合考虑确定TDZ 1.0 mg·L-1为全明星草莓叶片再生的适宜浓度。⑶IBA和NAA都是在浓度为0.05 mg·L-1时再生效果最好,叶片分化率分别为68.99 %和38.93 %。0.05 mg·L-1的IBA和1.0 mg·L-1的TDZ配合使用是适用于的全明星草莓叶片再生的最佳激素处理。较高浓度的NAA(0.2 mg·L-1~0.3 mg·L-1)处理中,再生的不定芽玻璃化率较高。同水平的IBA与TDZ组合,叶片分化率、平均不定芽位点数和平均每叶片再生不定芽数均显著高于NAA与TDZ组合。⑷不经暗培养的叶片再生频率较低,随着暗培养时间的延长,叶片分化率和平均不定芽位点数都呈上升趋势,暗培养9天和12天的叶片分化率分别为40.54%和34.29%,显著高于其他处理。(三)遗传转化体系的建立⑴Cef 200 mg·L-1时组培苗植株及侧芽生长都基本正常,达到或超过300 mg·L-1植株生长及侧芽分化都受到明显抑制。200 mg·L-1 Cef可基本抑制农杆菌的生长。Km 20 mg·L-1可抑制非转化芽分化,可用于抗性不定芽筛选。⑵农杆菌LBA4404在菌液浓度为OD600=0.5左右时,菌体增殖最快;预培养3天的叶片抗性不定芽生成率最高,为18.9 %,与其他预培养时间处理间差异极显著;附加10 mg·L-1或20 mg·L-1的AS,抗性不定芽的分化率从7.53%分别提高到15.09 %和14.55 %。⑶用OD600为1.0重悬菌液侵染叶片比用OD600为0.5的原菌液侵染效果好,抗性不定芽分化率由6.15 %提高到15.8 %;用不同浓度的重悬菌液侵染叶片,OD600为1.0时效果最好,抗性不定芽生成率为18.55%。适宜的浸染时间为10 min,抗性不定芽生成率最高,为21.46 %。⑷不同共培养时间和脱菌培养时间的组合以共培养3天,脱菌培养3天的叶片分化率、抗性不定芽位点数、每叶盘不定芽数最高,分别为13.49 %、0.18、0.22,是全明星草莓遗传转化的最适时间组合。经Km筛选,GUS组织化学染色和PCR检测,共得到7个株系的转基因植株。