类风湿关节炎(RA)是一类复杂的、多系统性的疾病,其主要关节病理表现以滑膜增生、炎细胞浸润和血管新生为主。RA关节病变中,成纤维样滑膜细胞(FLS)不仅是被动的反应者,它还积极的参与滑膜的炎症免疫反应,可以分泌大量细胞因子、趋化因子、生长因子以及表达各种粘附分子来启动、扩增以及维持慢性炎症。血管新生主要依赖于内皮细胞的激活、迁移和存活,抑制血管的新生,可有效抑制滑膜炎症和血管翳的形成。RA滑膜可以促进血管新生,而血管新生又为滑膜增生提供支持。TNF-α是最强的促炎细胞因子之一,在RA病人的滑膜液中明显升高。TNF-α可以促进滑膜增殖和分泌功能,并且可以激活内皮细胞促进血管新生。抗TNF-α抗体治疗关节炎模型动物和RA病人已经取得很好的疗效,有效缓解临床症状。β肾上腺素受体(β-AR)表达在多种免疫细胞上,并调节它们的功能。RA进程中,β-AR在多种免疫细胞上表达变化,影响免疫细胞功能。但β-AR信号对滑膜细胞功能和血管新生的作用以及TNF-α是否影响β-AR信号未见文献报道。新型活性单体-苯磺酰芍药苷(芍药苷-6-氧-苯磺酸酯,代号CP-25)是将白芍中的活性单体芍药苷(Paeoniflorin, Pae)进行酯化修饰而得到的具有抗炎免疫作用的药物。前期实验已经证实CP-25对佐剂性关节炎(AA)有治疗作用,并且可调节小鼠的骨髓源树突细胞(DC)功能,但对胶原性关节炎(CIA)的作用以及机制还不清楚。本课题在以往研究工作基础上,建立小鼠CIA模型,观察CP-25对小鼠CIA的治疗作用与β-AR信号的关系。以人的FLS和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究细胞,运用流式细胞术、免疫印迹、免疫共沉淀、激光共聚焦,免疫荧光等技术,观察β-AR信号对滑膜细胞和内皮细胞功能的影响及CP-25的作用,探讨β-AR及其信号对滑膜细胞和内皮细胞功能的调节作用,进一步研究该信号通路异常变化对滑膜细胞和内皮细胞功能的影响及机制,为揭示β-AR信号转导参与RA异常炎症免疫反应的病理机制及CP-25的作用靶点提供实验依据。目的：明确β-AR信号对滑膜细胞和内皮细胞功能以及相互作用的影响；CP-25对小鼠CIA的关节治疗作用与β-AR信号之间的关系,为揭示β-AR信号通路参与RA滑膜病理过程的机制以及CP-25的作用靶点提供实验依据。方法：1.选用DBA/1小鼠,用鸡II型胶原乳剂制备小鼠CIA模型,CP-25灌胃给药,进行关节炎指数评分,关节病理HE染色检查和病理学评分；免疫组化法检测关节组织β-AR达的变化；ELISA法检测关节组织匀浆上清TNF-α的水平。2.CCK-8法检测FLS的细胞活力同时反映细胞增殖情况；Transwell小室法检测滑膜细胞的迁移和侵袭能力；流式细胞术检测滑膜细胞表面β2-AR和GRK2；Western blot法检测β2-AR和GRK2的膜表达；激光共聚焦显微镜法检测β2-雠滑膜细胞上的分布情况；ELISA法检测cAMP的水平。Transwell小室法共培养FLS和]HUVEC.3.CCK-8法检测]HUVEC的细胞活力同时反映细胞增殖情况；Transwell小室法检测HUVEC的迁移；体外基质胶成管实验检测HUVEC的成管数；流式细胞术和Western blot检测]HUVEC表面β2-AR;免疫荧光法检测β2-AR在HUVEC上的表达情况。结果：1.CP-25对CIA小鼠的治疗作用免疫后d32小鼠足爪出现较明显红肿,进行性加重,关节炎指数升高。d40-d48,CP-25(35mg/kg,70mg/kg)用药组可显著降低CIA小鼠关节炎指数。CIA小鼠关节腔可见滑膜组织增生,衬覆多层滑膜细胞,炎性细胞浸润,血管扩张充血,血管翳出现,甚至出现骨和软骨破坏。CP-25(35mg/kg,70mg/kg)用药组可不同程度的改善小鼠关节滑膜细胞增生、炎细胞浸润、血管扩张充血、血管翳生成等病理变化,可显著降低滑膜细胞增生和血管翳的形成病理评分。CIA小鼠关节组织处理切片,免疫组化法检测关节滑膜组织β-AR的表达情况；结果显示,CIA组关节滑膜组织β-AR表达减弱,CP-25(70mg/kg)组关节β-AR表达明显增强。ELISA法检测关节组织匀浆上清,CIA小鼠模型组TNF-α水平明显升高,CP-25(70mg/kg)组显著降低TNF-α水平。2.β-AR信号对TNF-α诱导的FLS异常活化的影响作用β-AR激动药ISO(1μM,10μM)能明显抑制TNF-α诱导的FLS增殖、迁移和侵袭。加入β1-AR选择性拮抗剂CGP20712A(1μM)和β2-AR选择性拮抗剂ICI118551(1μM),发现其抑制增殖、迁移和侵袭作用主要通过β2-AR信号实现的。接着ELISA法检测FLS的cAMP水平,结果显示,TNF-α组FLS的cAMP水平明显降低,ISO(1μM)可以升高TNF-α诱导FLS的cAMP水平。根据以上结果我们推断β2-AR信号可能通过升高cAMP水平来调节FLS功能。正常人FLS与HUVEC共培养后,HUVEC的增殖、迁移和基质胶体外成管能力没有明显变化,与TNF-α活化的FLS共培养后,HUVEC的增殖、迁移和基质胶体外成管能力明显增加,提示TNF-α活化的FLS可以活化HUVEC;而沙丁胺醇(1μM)+TNF-α组的HUVEC的增殖,迁移和体外成管能力明显降低,提示β2-AR信号可以阻断TNF-α活化的FLS对HUVEC的活化作用,推测其机制可能与β2-AR信号抑制FLS活化有关。3.β-AR信号对HUVEC活化的影响及CP-25的作用TNF-α(1.25ng/ml,2.5ng/ml,5ng/ml, 10ng/ml,20ng/ml)诱导HUVEC增殖12h、24h、36h、48h,选择亚适浓度2.5ng/ml,最适时间24h用于后续实验。ISO(1μM,10μM)明显抑制HUVEC增殖,而对TNF-α诱导的HUVEC增殖无抑制作用。分别加入β1-AR选择性拮抗剂CGP20712A(1μM)和β2-AR选择性拮抗剂ICl118551(1μM),结果显示,阻断β2-AR可以拮抗ISO对HUVEC增殖作用,而阻断β1-AR无明显作用,提示ISO抑制HUVEC增殖作用主要通过β2-AR实现的。为何ISO(1μM,10μM)对TNF-α诱导的HUVEC增殖无抑制作用?我们用流式细胞术,western blot和免疫荧光法检测了TNF-α诱导的HUVEC胞膜β2-AR表达。结果显示TNF-α刺激HUVEC24小时后胞膜β2-AR表达明显减少,我们推断TNF-α减少HUVEC胞膜β2-AR表达,从而阻断了β2-AR信号对HUVEC增殖的抑制作用。为了进一步验证这一推断,我们观察了β2-AR受体激动剂沙丁胺醇(1μM)对TNF-α诱导的HUVEC的异常活化的作用。结果显示β2-AR受体激动剂沙丁胺醇(1μM)对TNF-α诱导的HUVEC的增殖、迁移和基质胶体外成管无明显抑制作用。进一步验证了TNF-α减少HUVEC胞膜β2-AR表达,从而阻断了β2-AR信号对HUVEC异常活化的抑制作用。在此基础上我们观察了CP-25的作用,结果显示CP-25(0.1μM,1μM,10μM)可以恢复沙丁胺醇对TNF-α诱导的HUVEC的增殖、迁移和基质胶体外成管的抑制作用。Western blot结果显示CP-25(0.1μM,1μm,10gM)可以升高TNF-α诱导的HUVEC胞膜β2-AR表达,提示CP-25可能通过升高HUVEC胞膜β2-AR表达,恢复β2-AR信号对HUVEC功能的抑制。4.TNF-α对滑膜细胞β2-AR信号的影响及CP-25的作用为了进一步探讨在RA疾病状态下,β-AR信号表达是否发生变化以及这种变化对FLS功能的影响,我们选取MH7A细胞株,一种类风湿性成纤维样滑膜细胞进行实验。我们观察到在MH7A细胞上ISO对其功能无明显作用,用Western blot,流式细胞仪和激光共聚焦观察MH7A胞膜β2-AR表达变化,结果显示TNF-α诱导的MH7A胞膜β2-AR表达明显减少。考虑是否RA病理状态下滑膜细胞上β2-AR表达发生了变化,并且这种变化是否与TNF-α水平升高有关。为了验证假设,我们将FLS用TNF-α (20ng/ml)预处理过夜模拟RA关节炎症环境,以β2-AR激动剂沙丁胺醇(salbutamol)(1μM)刺激,观察β2-AR膜表达,脱敏相关蛋白GRK2及其下游信号cAMP水平。结果显示,与正常对照组比较,TNF-α组在5min、10min、20min FLS胞膜β2-AR表达减少更明显,而GRK2膜表达增加更明显。其下游信号cAMP水平在同等条件下TNF-α组降低更明显。免疫共沉淀法检验β2-AR是否与GRK2蛋白共定位,结果显示TNF-α组β2-AR-GRK2偶联更明显。这些结果表明,TNF-α可以增加FLS胞膜上GRK2表达,促进GRK2与胞膜上β2-AR的偶联；提示,TNF-α通过促进β2-AR脱敏,减少β2-AR膜表达,降低下游信号cAMP水平,从而促进FLS异常活化。用流式细胞术和Western blot检测发现CP-25可以使TNF-α诱导的MH7A细胞胞膜GRK2水平减少,β2-AR表达增加。CP-25(1μM,10μM)可以明显恢复ISO对TNF-α诱导的MH7A细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用。提示CP-25可以减少胞膜GRK2水平,使胞膜β2-AR水平增加,增加β2-AR信号对FLS功能的抑制。结论：1.CP-25对CIA小鼠具有治疗作用,可以抑制滑膜增生、抑制血管翳的形成,这些作用可能与其升高CIA小鼠滑膜β-AR表达,降低TNF-α水平有关。2.β2-AR信号参与了FLS和HUVEC的功能调节以及FLS对HUVEC的功能调节。3. TNF-α异常升高,导致FLS细胞膜上β2-AR表达下降(过度脱敏),与FLS功能异常有关。4. TNF-α可以促进FLS胞膜GRK2水平升高,增加GRK2与β2-AR的偶联,可能是导致β2-AR脱敏的主要原因。5.CP-25对TNF-α诱导的FLS和HUVEC的功能调节作用可能与其抑制TNF-α诱导的β2-AR脱敏有关。