引言结肠癌（colorectalcancer,CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升的趋势,且发病年龄有年轻化趋势。结直肠癌的流行病学特点具有明显的地域性差异:在北美和北欧地区居首位,而在亚洲和非洲的发病率很低。随着精准医学时代的来临,结肠癌的治疗主要以手术切除为主,辅以化疗、免疫和靶向治疗等多学科综合治疗模式。虽然治疗水平在提高,但其死亡率仍未能明显降低,究其原因主要是部分患者容易出现局部复发或远处转移。结肠癌的侵袭转移是一个复杂的多级生物学过程,其主要包括上皮间质转化、分泌蛋白溶解酶和趋化因子、移出血管或淋巴管形成微型转移结节等。侵袭转移是结肠癌治疗的难点。因此,研究结肠癌侵袭转移的机制和寻找能高效抑制结肠癌转移的药物就显得尤为重要。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸,不具备编码蛋白功能的RNA分子。随着分子生物信息学技术的快速发展,很多研究已经证实lncRNA参与多种疾病的发生发展,尤其是恶性肿瘤。LncRNA可以通过多种方式参与恶性肿瘤的发生发展,例如染色质重构、调节DNA甲基化、组蛋白修饰、调节原癌基因活化和作为miRNA的前体等。近几年已经有大量研究报道许多lncRNA与结肠癌发生发展密切相关。因此,在结肠癌中挖掘出新的具有生物学功能lncRNA,可以为有效抑制结肠癌侵袭转移提供新的理论依据。南蛇藤,系卫矛科南蛇藤属植物,其藤茎、根、果实、叶均可入药,主要有倍半萜、三萜类、甾体类、有机酸类、黄酮类、鞣质等活性成份。国内外现代药理研究也表明,在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等方面都有一定的作用。课题组长期从事中药南蛇藤提取物（Celastrus orbiculatus extract,COE）（专利授权号:200710025343.3）抗肿瘤的药效学研究。前期研究发现:南蛇藤提取物可明显抑制人结肠癌HT 29细胞的生长并诱导其凋亡,其机制可能是通过调控PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路。但南蛇藤提取物是否可以通过表观遗传学作用方式去抑制结肠癌的发生发展未见有报道。因此本研究以COE作用于HT29细胞后进行高通量测序为切入点,明确南蛇藤提取物是否可以通过调控lncRNA表达,从而发挥抑制结肠癌侵袭转移的作用。本课题分为如下四部分研究内容。第一部分:南蛇藤提取物通过lncRNA 604抑制结肠癌侵袭转移目的:研究COE作用结肠癌细胞HT29后lncRNA表达差异的变化;高通量Celigo方法筛选并确定具有生物学功能的lncRNA;明确lncRNA 604是否具有生物学功能;阐明COE可能通过lncRNA 604抑制结肠癌侵袭转移,为开发抑制结肠癌转移的药物寻找新的靶标。方法:体外培养人结肠癌细胞HT 29和HCT 116,用COE的不同浓度处理（50、100、200、400 μg/mL）作用于细胞后,采用 MTT 法检测 48 h 的 50%concentration of inhibition（IC50）浓度。然后选取1/2 IC50浓度作为后续高通量测序实验的药物浓度。通过高通量测序筛选出表达明显差异的lncRNA,然后根据Fold change≥2 lncRNA作为验证对象。采用高通量Celigo筛选并确定具有生物学功能的lncRNA:lncRNA604。构建lncRNA 604高、低稳定表达的病毒,并用qRT-PCR验证病毒干扰效果。MTT 比色法、EdU细胞增殖法检测lncRNA604对结肠癌细胞增殖的影响。Transwell法、高内涵细胞迁移实验检测lncRNA 604对结肠癌细胞侵袭转移的影响。采用裸鼠皮下移植瘤模型观察lncRNA 604在体内促进结肠癌生长的作用;裸鼠腹腔移植瘤、裸鼠尾静脉转移模型验证lncRNA 604在体内促进结肠癌转移的作用。通过裸鼠皮下移植瘤模型观察COE在体内是否通过调控lncRNA604抑制结肠癌生长。结果:COE作用于两种结肠癌细胞后,细胞增殖能力明显降低,且呈浓度和时间依赖性（P＜0.01）。经计算48 h的半数抑制浓度IC50:HCT 116约138μg/mL、HT 29约176μg/mL。COE作用于HT 29细胞48 h后进行高通量测序,结果显示:加药组与阴性对照组相比,筛选出高表达lncRNA 862条、低表达lncRNA 1062条。根据Fold change≥2 lncRNA作为验证对象,用qRT-PCR进行逐一验证。采用高通量Celigo筛选并确定具有生物学功能的lncRNA:lncRNA 604。通过MTT 比色法、EdU细胞增殖法证实lncRNA604能够促进结肠癌细胞增殖。Transwell法、高内涵细胞迁移实验结果证实lncRNA 604能够促进结肠癌细胞侵袭转移。裸鼠体内实验证实lncRNA 604在体内促进结肠癌移植瘤和转移瘤的生长。通过裸鼠皮下移植瘤模型,证实COE在体内通过调控lncRNA604抑制结肠癌生长。结论:lncRNA 604促进结肠癌增殖,侵袭转移;COE可能通过调控lncRNA 604抑制结肠癌转移。第二部分:LncRNA 604通过miRNA 564/AEG-1或ZNF326调控EMT,从而促进结肠癌细胞侵袭转移目的:研究lncRNA 604下游空间信号调控网络机制;明确lncRNA 604在细胞中的定位;明确与lncRNA604绑定在同一空间的所有miRNA;筛选出受miRNA-564调控的所有蛋白;阐明lncRNA 604在细胞核内绑定并调控核转录因子的作用方式。方法:采用FISH法检测lncRNA 604在HT 29中的表达定位。运用TargetScan软件来预测lncRNA 604的ceRNA机制所涉及的空间信号调控网络,用RT-PCR逐一验证lncRNA 604和miRNA的关联性。采用生物信息学方法和双荧光素霉报告基因方法验证 lncRNA604 与 miRNA564 的关联性。通过 MiRanda 网站（http://www.microrna.org）预测受miRNA564调控的靶向蛋白。采用生物信息学方法、双荧光素霉报告基因、RT-PCR和免疫印迹法验证miRNA 564和AEG-1的关联性。采用RNA pull down实验拉下与lncRNA604结合的所有蛋白,然后将这些的蛋白进行质谱分析出差异蛋白,再用免疫印迹法验证。结果:LncRNA604在HT29中大部分表达在细胞浆中,但仍有少部分表达定位在细胞核。TargetScan 软件来预测出 lncRNA 604 能够与 miRNA 564,miRNA 146b-3p,miRNA 1976等绑定在一起。利用RT-PCR逐一验证,结果显示:LncRNA604能够通过负性调控miRNA 564。利用生物信息学方法预测LncRNA 604与miRNA 564的结合位点。采用双荧光素霉报告基因方法,结果显示:miRNA564可以降低野生型lncRNA604荧光素酶活性,但对突变型lncRNA 604活性没有变化;miRNA 564与野生型lncRNA 604相互结合。通过MiRanda网站预测受miRNA564调控的主要靶向蛋白:星形细胞上调基因1（astrocyte elevated gene-1,AEG-1）,利用生物信息学方法预测miRNA 564与AEG-1的结合位点。采用双荧光素霉报告基因法证实miRNA564能够绑定野生型AEG-1。采用RT-PCR和免疫印迹法证实无论在mRNA或者蛋白水平,miRNA 564均能够负性调控AEG-1。RNA pull down实验银染图上显示:lncRNA 604正义链与反义链探针两组所结合的蛋白存在明显差异。然后将这些的蛋白进行质谱分析发现:差异蛋白中核转录因子锌指蛋白326（ZNF326）位列第二。利用免疫印迹再次验证了 lncRNA604能够与ZNF326相互结合在一起,并能正性调控ZNF326,从而导致EMT的发生。结论:lncRNA604不仅在细胞浆中能够通过绑定miRNA564抑制AEG-1,而且在细胞核内能够直接正性调控核转录因子ZNF326,从而促进EMT的发生并导致结肠癌转移。第三部分:LncRNA 604及受其调控的分子预测结肠癌患者预后目的:研究lncRNA604及受其调控的分子是否可以预测结肠癌患者预后。明确lncRNA 604及受其调控的分子在预测结肠癌预后方面是否具有协同作用。方法:高通量测序比对结肠癌组织与相对应癌旁组织中lncRNA 604表达;RT-PCR检测lncRNA 604在结肠癌组织与细胞中的表达;利用FISH方法检测470例结肠癌数据库组织芯片中的lncRNA604、miRNA564表达;采用IHC方法检测组织芯片中ZNF326的表达;运用Image-Pro Plus 6.0软件分析LncRNA 604、miRNA564荧光表达数值;ZNF326的染色强度分别由两名病理学专家通过半定量免疫反应评分系统进行评估;采用Kaplan-Meier生存分析法绘制生存曲线;COX回归模型分析lncRNA604、miRNA564、ZNF326与结肠癌预后的相关性。结果:高通量测序提示lncRNA 604表达在结肠癌组织中比相对应癌旁组织中明显升高;RT-PCR检测发现lncRNA 604在结肠癌组织中的表达较对应癌旁组织中明显升高（P＜0.001）、结肠癌细胞中lncRNA604表达较FHC中也明显升高（P＜0.001）;470例结肠癌数据库组织芯片上结肠癌组织中lncRNA604的表达明显增加（P＜0.001）;采用Fisher检验方法分析,结果发现:lncRNA604表达与淋巴结转移、TNM分期和远处转移均呈显著正相关（P＜0.001）;Kaplan-Meier生存曲线分析发现:lncRNA604低表达的结肠癌患者OS较lncRNA604高表达的患者明显延长（P＜0.001）;COX单因素、多因素回归模型分析lncRNA 604是结肠癌患者预后差的独立分子标志物（P＜0.001）。FISH法检测结肠癌数据库组织芯片中miRNA564的表达,结果发现:结肠癌组织中miRNA564的表达较癌旁组织明显降低（P＜0.001）。Fisher检验方法分析:miRNA564表达与浸润深度、淋巴结转移、TNM分期和远处转移呈显著正相关（P＜0.001）。COX回归模型分析,结果所示:miRNA564是结肠癌患者预后好的独立分子标志物（P＜0.001）。采用免疫组化法检测结肠癌组织芯片中的ZNF326蛋白表达,分析发现:结肠癌组织中ZNF326蛋白的表达较癌旁组织明显增加（P＜0.001）。采用Kaplan-Meier生存曲线分析发现:ZNF326蛋白高表达的结肠癌患者总生存期（overall survival,OS）较ZNF326低表达的患者明显缩短（P＜0.001）。COX回归模型分析,结果所示:ZNF326是结肠癌患者预后差的独立分子标志物（P＜0.001）。LncRNA604联合miRNA564、lncRNA604联合ZNF326预测结肠癌患者预后均具有协同作用（P＜0.001）。结论:LncRNA 604、miRNA564和ZNF326均是结肠癌患者预后的独立分子标志物。LncRNA604联合miRNA564或ZNF326均能更好地预测结肠癌患者预后,具有协同作用。这些结论为临床上预测结肠癌患者预后提供了新的标志物。第四部分:LncRNA 604预测结肠癌患者术后化疗疗效目的:研究lncRNA 604是否可以预测术后辅助化疗疗效。方法:采用Kaplan-Meier生存曲线法分析结肠癌数据库中lncRNA604表达与术后化疗疗效的相关性;采用MTT法检测5-FU联合L-OHP作用lncRNA 604高、低稳定表达结肠癌细胞株后增殖能力的变化;采用RT-PCR和免疫印迹法来检测lncRNA 604高、低稳定表达结肠癌细胞株中相关耐药基因的mRNA、蛋白水平;裸鼠皮下移植瘤模型和小动物活体成像系统研究lncRNA604与化疗药物耐药的相关性;采用免疫组化法检测皮下移植瘤中AEG-1、核因子κB（nuclearfactorkappa-B,NF-κB）和核苷酸切除修复交叉互补基因 1（nucleotide excision repair cross complementary gene 1,ERCC1）的蛋白表达。结果:Kaplan-Meier生存曲线法分析结果发现:与单独接受手术的患者相比,lncRNA 604低表达患者术后行LFP方案的总生存时间明显延长（P＜0.05）,而lncRNA604高表达患者术后行LFP方案则不能受益（P＞0.05）。采用MTT法检测结果显示:5-FU和L-OHP各20μg/ml联合作用于细胞株后,lncRNA604低表达结肠癌细胞株更加敏感（P＜0.05）;而lncRNA604高表达细胞株不敏感（P＞0.05）,分别与各自对照组相比。采用RT-PCR和免疫印迹法来检测,结果显示:与各自对照组相比,lncRNA 604高表达细胞中AEG-1、NF-κB和ERCC1的mRNA和蛋白表达均明显升高,而低表达则反之;裸鼠体内实验结果所示:lncRNA 604低表达组皮下移植瘤体积明显缩小（P＜0.05）,而lncRNA 604高表达组未见明显差异（P＞0.05）。皮下移植瘤免疫组化结果显示:lncRNA604高表达组中AEG-1、NF-κB和ERCCl的表达较高,而lncRNA604低表达组则相反。结论:lncRNA604能够预测术后辅助化疗疗效:lncRNA604低表达结肠癌患者术后采取LFP方案化疗与单纯手术者相比,能明显延长OS;而lncRNA 604高表达结肠癌未能获益。lncRNA 604可能通过增强AEG-1、NF-κB和ERCC1的表达来提高结肠癌细胞对化疗药物的耐药性。