背景流行病学资料显示,世界恶性肿瘤排名中,食管癌发病率为全球第7位,死亡率为全球第6位,是目前最常见的恶性肿瘤之一。在消化道恶性肿瘤中仅次于胃癌,居第二位。食管癌发病具有明显的地域性分布的特点,我国处于食管癌高发地区,它是严重影响我国人民健康最常见的恶性肿瘤之一。90%以上的食管癌病理类型为鳞状细胞癌。食管鳞癌侵袭性强,进展迅速,总体预后差。研究表明,影响食管鳞癌病人预后的因素很多,如肿瘤的发生部位、组织学分化程度、浸润深度、淋巴结转移的数目和比例以及临床TNM分期等。目前尽管治疗食管鳞癌的方法多样,如手术、放疗、化疗以及联合多种方法的综合治疗等,但患者的生存预后并未得到明显改善,5年生存率仍徘徊在5%-45%。研究表明,癌基因的活化和肿瘤抑制基因的失活是肿瘤发生、发展中的关键因素,因此,解析肿瘤发生、发展及进展中关键基因的功能有助于发现新的治疗靶点。现阶段,针对肿瘤发生、发展及进展过程中关键基因的分子靶向治疗研究进展迅速,因其毒副作用小、患者耐受度好、疗效显著,已经成为临床肿瘤治疗的一个新方向。如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制剂-吉非替尼,在治疗伴有EGFR基因突变的非小细胞肺癌患者的研究中显示能够延长病人的生存时间、毒副作用小,患者易耐受;曲妥珠单抗(赫赛汀)治疗伴有人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)基因过度表达的转移性乳腺癌患者疗效显著。目前关于食管鳞癌分子靶向治疗方面的研究较少。仅有小样本临床试验研究显示,EGFR抑制剂吉非替尼、盐酸厄洛替尼及尼妥珠单抗对部分食管鳞癌患者有一定疗效。因此,寻找更多、更为有效的针对食管鳞癌的分子靶向基因对其防治具有重大意义。淋巴细胞抗原6复合物家族(Lymphocyte antigen 6 complex,Ly6)是一类小的富含半胱氨酸的细胞表面蛋白。它包含一组同种异体抗原,由多个基因编码,主要表达于造血细胞中,且在造血细胞中呈差异性表达,尤其是在T淋巴细胞中,因而该家族成员在信号转导、补体膜攻击复合体及T细胞活化等细胞免疫中发挥着重要作用。研究表明,Ly6也参与了肿瘤的发生、发展过程。淋巴细胞抗原6复合物E(Lymphocyte antigen 6 complex,locus E,Ly6E)又称为干细胞抗原2(stem cell antigen 2,SCA2)和胸腺共同抗原-1(thymic shared antigen-1,TSA-1),是Ly6超家族成员之一。研究显示,Ly6E在多种恶性肿瘤中表达上调,如肺癌、胃癌、乳腺癌等;且其表达水平与肿瘤的分化程度和/或临床预后密切相关,提示,Ly6E参与了肿瘤的发生、发展及进展过程。另有研究表明,Ly6E siRNA能降低胃癌细胞的迁移能力,并伴随PTEN和E-cadherin表达的上调;Ly6E作为促进乳腺癌转移的关键调控因子,下调其表达能显著抑制乳腺癌的侵袭和转移等,以上研究均提示Ly6E可能在介导以上癌细胞的侵袭和转移中发挥重要作用。另外,Ly6E表达上调与抑癌基因PTEN的表达下调相关,并能激活PI3K/Akt信号通路的活性,上调缺氧诱导因子α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)的表达及活性,产生促进肿瘤细胞生长、抑制细胞凋亡、诱导肿瘤血管生成、促进细胞侵袭和转移的生物学作用。2016年Khammanivong A等通过转录组分析研究发现,用去甲基烟碱亚硝胺(N’-Nitrosonornicotine)诱发的大鼠肿瘤中,Ly6E在诱发的食管癌中表达显著上调,提示Ly6E在食管癌的发生、发展中可能发挥着重要作用,其很有可能成为食管鳞癌患者极好的治疗靶点。目前为止,国内外尚未有关于Ly6E在人食管鳞癌中的表达及其作用机制的研究。目的为了阐明Ly6E在人食管鳞癌发生、发展及浸润、转移中的作用及机制,以期为食管鳞癌寻找新的有效的治疗靶标,本课题主要从以下3方面进行研究:首先利用免疫组织化学EnVision法检测并比较Ly6E蛋白在食管鳞癌组织及其相对应的正常食管粘膜组织中的表达,分析Ly6E蛋白表达与食管鳞癌患者临床病理学参数之间的关系,初步阐明Ly6E在食管鳞癌发生、发展中的作用;随机选取其中的4例新鲜食管鳞癌组织及其相对应的新鲜正常食管粘膜组织,联合运用Western blot和实时荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术检测其中的Ly6E蛋白和mRNA的表达水平,初步验证Ly6E在mRNA水平与蛋白表达的一致性。其次,通过RNA干扰技术(RNAi)下调食管鳞癌细胞中Ly6E的表达,用CCK-8试剂盒法、流式细胞术、Transwell小室等方法观察Ly6E表达下调对食管鳞癌细胞增殖、周期、凋亡、迁移及侵袭能力的影响,同时检测上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)信号途径中的关键分子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和ZEB1的表达,探讨引起食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力下降的可能机制,更为重要的是,分析Ly6E表达下调与食管鳞癌PTEN/Akt信号途径的关系,在体外水平进一步分析Ly6E在食管鳞癌发生、发展及浸润、转移中的作用及机制;最后,构建转染Ly6E siRNA的食管鳞癌裸鼠移植瘤模型,观察体内Ly6E表达下调对食管鳞癌细胞生长的影响及对E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和ZEB1表达的调控,从体内角度进一步验证Ly6E在食管鳞癌中的作用及机制,为Ly6E作为治疗人食管鳞癌的有效靶基因提供理论和实验依据。第一部分Ly6E在食管鳞癌中的表达及其与患者临床病理学特征之间的关系方法1.采用免疫组织化学EnVision法分别检测89例食管鳞癌组织及其相对应的正常食管粘膜组织中Ly6E蛋白的表达,并分析Ly6E蛋白表达与患者临床病理学参数之间的相关性。2.应用实时荧光定量PCR技术及Western blot技术检测并分析4例随机选取的新鲜食管鳞癌组织及其相对应的正常食管粘膜新鲜组织的Ly6E mRNA和蛋白的表达情况。3.统计学方法:用SPSS17.0版本软件对数据进行统计分析。两组和多组计数资料的比较均采用卡方检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.与正常的食管粘膜组织相比,Ly6E蛋白在食管鳞癌组织中的表达明显上调,差异具有显著统计学意义(P<0.01);Ly6E蛋白的阳性信号主要定位于细胞膜和/细胞质,呈棕黄色颗粒状着色。2.Ly6E蛋白表达与食管鳞癌病人的TNM分期、浸润深度、组织学分级及淋巴结转移均密切相关,组间比较差异具有统计学意义(P<0.01);与患者的年龄、性别、肿瘤的直径及大体类型均无关,组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。3.4例食管鳞癌新鲜组织中Ly6E mRNA和蛋白的表达均高于其相对应的正常食管粘膜新鲜组织,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。第二部分Ly6E表达下调通过PTEN/Akt信号途径发挥抗食管鳞癌的作用方法1.应用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术分别检测并比较Ly6E mRNA和蛋白在食管鳞癌细胞(Eca109、EC9706、EC1、TE1和KYSE70)和正常食管鳞状上皮细胞(Het-1A)中的表达水平。2.利用RNA干扰技术(RNAi技术),分别转染Ly6E siRNA和对照siRNA至食管鳞癌EC9706和EC1细胞中;采用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术检测并分析Ly6E siRNA组、对照siRNA组和未处理组(正常培养的食管鳞癌EC9706和EC1细胞)细胞中Ly6E mRNA和蛋白的表达情况。3.采用CCK-8试剂盒法分析转染Ly6E siRNA对食管鳞癌EC9706和EC1细胞增殖能力的影响。4.采用流式细胞术和Annexin V-FITC/PI双染法分析转染Ly6E siRNA对食管鳞癌EC9706和EC1细胞周期和凋亡的影响。5.采用Tranwell小室法分析转染Ly6E siRNA对食管鳞癌EC9706和EC1细胞迁移和侵袭能力的影响。6.采用实时荧光定量PCR技术分析转染Ly6E siRNA对食管鳞癌EC9706和EC1细胞EMT信号途径关键分子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和ZEB1 mRNA表达的影响。7.采用Western blot技术检测转染Ly6E siRNA后食管鳞癌EC9706和EC1细胞PTEN、p-Akt及总Akt蛋白表达的变化,分析Ly6E表达下调与食管鳞癌PTEN/Akt信号通路的关系。8.统计学方法:实验数据均采用GraphPad Prism 6.0软件进行分析处理,实验数据均用(?)±s表示,二组之间比较采用t检验,三组及三组以上采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05表示差异具有显著性意义。结果1.与正常食管上皮细胞Het-1A相比,食管鳞癌细胞Eca109、EC9706、EC1、TE1和KYSE70中Ly6E mRNA和蛋白的表达均显著上调,差异均具有显著性统计学意义(P<0.001)。其中Ly6E mRNA和蛋白在EC9706细胞中的表达量最高,EC1细胞次之。后续均选用以上两个细胞株进行实验。2.转染48h后,EC9706和EC1细胞中Ly6E mRNA和蛋白在Ly6E siRNA组中的表达均显著低于未处理组和对照siRNA组,差异均具有统计学意义(P<0.05);未处理组和对照siRNA组比较无显著性差异(P>0.05)。3.转染后24h、48h、72h和96h分别检测各组中EC9706和EC1细胞的增殖能力。与未处理组和对照siRNA组相比,Ly6E siRNA组的两种细胞中的增殖能力在各个时间节点均被抑制,差异均具有统计学意义(P<0.05);未处理组和对照siRNA组比较差异均无显著性(P>0.05)。4.转染48h后,EC9706和EC1细胞中处于G0/G1期的细胞数的比率在Ly6E siRNA组均显著高于未处理组和对照siRNA组,差异均具有统计学意义(EC9706细胞:F=176.260,P=0.000;EC1细胞:F=104.834,P=0.000);未处理组与对照siRNA组比较均无显著性差异(EC9706细胞:P=0.939;EC1细胞:P=0.25);两种细胞中处于S期的细胞数的比率在Ly6E siRNA组均显著低于未处理组和对照siRNA组,差异均具有统计学意义(EC9706细胞:F=56.798,P=0.000;EC1细胞:F=53.610,P=0.000),未处理组和对照siRNA组比较均无显著性差异(EC9706细胞:P=0.25;EC1细胞:P=0.320)。5.转染48h后,Ly6E siRNA组中EC9706和EC1细胞的凋亡数量显著高于未处理组和对照siRNA组,且差异均具有统计学意义(EC9706细胞:P<0.0001;EC1细胞:P<0.0001);未处理组和对照siRNA组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。6.转染48h后,与未处理组和对照siRNA组相比,Ly6E siRNA组中EC9706和EC1细胞迁移的数量均显著下降,差异均具有统计学意义(EC9706细胞:P<0.001;EC1细胞:P<0.01);未处理组与对照siRNA组相比均无显著性差异(P>0.05)。7.转染48h后,与未处理组和对照siRNA组相比,Ly6E siRNA组EC9706和EC1细胞侵袭的数量在均显著下降,差异均具有统计学意义(EC9706细胞:P<0.01;EC1细胞:P<0.05);未处理组与对照siRNA组相比均无显著性差异(P>0.05)。8.转染48h后,EC9706和EC1细胞中E-cadherin mRNA的表达在Ly6E siRNA组均显著高于未处理组和对照siRNA组,而N-cadherin、Vimentin和ZEB1 mRNA的表达均显著低于未处理组和对照siRNA组,差异均具有统计学意义(EC9706细胞:P<0.001;EC1细胞:P<0.0001)。9.转染48h后,与未处理组和对照siRNA组相比,Ly6E siRNA组EC9706和EC1细胞中PTEN蛋白的表达均显著上调(P<0.0001),p-Akt蛋白的表达均显著下调(P<0.0001),而总Akt蛋白的表达均无显著差异(P>0.05)。第三部分Ly6E对食管鳞癌裸鼠移植瘤生长及上皮间质转化(EMT)信号途径的影响方法1.将稳定转染Ly6E siRNA、对照siRNA的食管鳞癌EC9706细胞和未处理的食管鳞癌EC9706细胞分别注入裸鼠皮下,然后比较Ly6E siRNA组、对照siRNA组和未处理组裸鼠成瘤的大小及速度。2.采用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术检测并比较各组裸鼠移植瘤中Ly6E mRNA和蛋白的表达情况。3.采用实时荧光定量PCR技术检测并比较各组裸鼠移植瘤新鲜组织中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和ZEB1 mRNA的表达情况。4.采用免疫组织化学EnVision法检测并比较各组裸鼠移植瘤组织中E-cadherin蛋白的表达情况。5.所有数据均采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,计数资料之间的比较采用χ~2检验,计量资料采用t检验(两组均数的比较)及方差分析(多组均数的比较),数值采用均数±标准差((?)±s)表示,P<0.05被认为差异具有显著性。结果1.成功构建Ly6E siRNA转染的食管鳞癌裸鼠移植瘤模型。Ly6E siRNA组的裸鼠移植瘤体积明显小于未处理组和对照siRNA组,差异具有统计学意义(P<0.001)。2.Ly6E siRNA组裸鼠移植瘤组织中Ly6E mRNA和蛋白的表达水平显著低于未处理组和对照siRNA组,差异具有统计学意义(P<0.01)。采用免疫组化EnVision法和Western Blot技术检测的结果一致。3.Ly6E siRNA组裸鼠移植瘤组织中E-cadherin mRNA和蛋白的表达均显著高于未处理组和对照siRNA组,差异均具有显著统计学意义(P<0.01);而N-cadherin、Vimentin和ZEB1 mRNA的表达均显著低于未处理组和对照siRNA组,差异均具有统计学意义(P<0.001)。结论1.Ly6E基因在食管鳞癌组织和细胞中的表达均显著上调,且与食管鳞癌的临床TNM分期、浸润深度、组织学分级及淋巴结转移显著相关。提示Ly6E与食管鳞癌的发生、发展及浸润、转移密切相关。2.体外Ly6E表达下调能够抑制食管鳞癌细胞的生长,且通过抑制EMT信号途径来降低其侵袭和迁移能力,提示Ly6E在食管鳞癌中发挥着癌基因的作用且参与其侵袭和转移的过程;Ly6E表达下调通过PTEN/Akt信号途径发挥抗食管鳞癌的作用。3.成功构建转染Ly6E siRNA的食管鳞癌裸鼠移植瘤模型。体内Ly6E表达下调能够抑制食管鳞癌移植瘤的生长、浸润及转移,提示Ly6E可以作为食管鳞癌有效的分子治疗靶点。