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目的:本实验通过分别构建针对HPV16 E6、E7和HPV18 E6、E7的miRNA干扰载体并转染SiHa(HPV16阳性的鳞癌)细胞和HeLa(HPV18阳性的腺癌)细胞,沉默E6、E7癌基因,观察抑制E6、E7基因对Hippo信号通路(主要效应分子Yap)和上皮-间质转化相关基因(E-cadherin和N-cadherin)表达的影响,探讨HPV E6、E7蛋白调节Hippo信号通路的可能机制,分析HPV与宫颈癌细胞发生上皮-间质转化(EMT)的相关性。方法:1.体外培养SiHa和HeLa细胞;2.分别设计针对HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6、HPV18E7的miRNA干扰质粒及1个阴性对照miRNA干扰质粒;3.应用脂质体瞬时转染技术分别转染SiHa和HeLa细胞,选择沉默效率较高的质粒进行后续稳定转染;4.构建分别沉默HPV16和HPV18 E6、E7基因的稳定转染细胞系;5.Real-Time PCR方法分别检测转染前后Yap和E-cadherin、N-cadherin的表达差异。结果:1.倒置相差显微镜观察结果:SiHa和HeLa细胞均生长旺盛,细胞形态呈现多样化;2.成功构建并转染质粒:针对SiHa细胞,转染质粒16E6-miR后HPV16E6 mRNA的表达明显降低,Real-Time PCR结果显示有效抑制率为77.6%;而质粒16E7-miR2和16E7-miR4可以有效抑制HPV16E7基因的表达,Real-Time PCR结果显示有效抑制率分别为67.2%和59.3%;因此在SiHa组中,以质粒16E6-miR和16E7-miR2构建稳定转染细胞系进行后续试验;针对HeLa细胞系,转染质粒18E6-miR后HPV18E6 mRNA的表达明显降低,Real-Time PCR结果显示有效抑制率为87.5%;而质粒18E7-miR1和18E7-miR4可以有效抑制HPV18E7基因的表达,Real-Time PCR结果显示有效抑制率分别为68%和45.6%,故在HeLa组中,以质粒18E6-miR和18E7-miR1构建的稳定转染细胞系进行后续实验;3.Real-Time PCR检测结果:HPVE6、E7基因表达被抑制后,Yap基因的表达明显降低,EMT标志物N-cadherin的表达明显降低,同时E-cadherin的表达明显升高。结论:在宫颈癌细胞中,HPV E6、E7可促进EMT,HPV E6、E7可能通过调节Hippo信号通路促进EMT过程。