背景:胃癌是世界上最常见、最具破坏性的恶性肿瘤之一,其发病率占全球癌症发病率的第5位,死亡率却高达第3位。胃癌是一组在生物学和遗传学上具有多样性的肿瘤类型,而且在其病因中有多种因素在起作用,包括环境因素和遗传因素。虽然内镜和影像技术提高了早期胃癌相关病变的检出率,但胃癌具有广泛的形态学异质性。单纯依靠形态学很容易忽视某些病例,大多数胃癌患者初诊时已处于中度或重度进展期;而生物标志物的应用可能会提高胃癌筛查的早期发现和诊断的准确性,以及包括癌症在内的各种疾病的预后和治疗。随着对胃癌发生发展的分子机制不断深入研究,到目前为止,针对少数胃癌患者的靶向治疗已经取代或补充了曲妥珠单抗和雷莫芦单抗,这两种单抗分别是HER-2或VEGFR2表达上调时治疗进展期胃癌的二线药物。PD-1抑制剂派姆单抗已被FDA批准为三线（或更高）治疗复发、局部进展期或转移性胃腺癌的药物。靶向治疗和免疫治疗为临床医生提供了一种治疗进展期胃癌患者的新方法,但多数靶向药物的临床效果仍不尽人意。因此,针对胃癌的个体化治疗迫切需要寻找在胃癌发生发展中敏感性和特异性较强的基因,并深入探索其发挥作用的分子机制,对胃癌的临床诊治及提供抗癌药物的研究靶点都具有重要的理论和实际意义。下一代测序（Next Generation Sequencing,NGS）是阐明人类癌症发病机制和确定潜在治疗靶点的一项强大技术。根据输入材料的不同,NGS的主要应用包括DNA测序、RNA测序和染色质免疫沉淀测序。NGS最初的应用集中在对个体基因组或各种组织的转录本进行测序,最近NGS在癌症生物学研究中的应用在几个方面给癌症研究带来了革命性的变化。近年来,随着高通量核酸合成方法和下一代测序（NGS）平台的发展,利用大型慢病毒库进行功能基因组学筛选成为可能,旨在发现新的癌症治疗靶点。目的:本研究我们将利用一个最初构建的针对所有人类代谢基因组的shRNA慢病毒文库,对人类胃癌细胞系进行了基于NGS的功能基因组学筛选,旨在筛选出靶向胃癌细胞的关键基因。同时利用人胃癌细胞株实验探讨靶基因在胃癌细胞中的生物学功能及其分子机制。研究方法:1)利用一个针对所有2,096个人类代谢基因的6,399个shRNA文库,对人类胃癌细胞株MKN1和HGC-27进行了基于NGS的功能基因组学筛选,筛选出分别具有生长抑制和生长促进的shRNA表型及胃癌相关差异表达基因。通过Enriched Pathway进行功能富集分析,得到生长表型功能相同的候选基因。2)利用GEPIA和Kaplan-Meier plotter公共数据库,分析氨酰-t RNA合成酶（Aminoacyl-t RNA synthases,ARSs）家族中不同候选基因在胃癌组织样本与正常胃粘膜组织样本的表达差异,并分析不同胃癌组织分型中DARS基因表达与预后的关系。通过346例胃癌患者的内部组织微阵列分析DARS基因的组织蛋白表达水平与患者临床病理特征的相关性。并利用弥漫型胃癌的基因工程小鼠模型进行DARS蛋白表达水平的验证。3)选取人胃癌细胞株MKN1和HGC-27,利用shRNA转染技术构建敲低DARS细胞模型,通过RT-q PCR及Immunoblot对敲低后的DARS表达量进行验证分析;并通过CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、Edu实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验及细胞迁移实验,验证敲低后的DARS对胃癌细胞的影响。4)我们建立了小鼠皮下荷瘤模型,进一步检测两种DARS基因敲低的胃癌细胞株在小鼠体内成瘤情况;并利用小鼠肿瘤进行HE染色及免疫组化分析。5)利用shRNA介导的DARS敲低后的胃癌细胞进行RNA高通量测序,分析DARS敲低后发挥抑制作用的分子通路机制。并利用Immunoblot的方法验证参与信号通路的下游关键转录因子的表达,以及DARS与Ca2+/MAPK/CREB/ELK-1信号转导通路的调控关系。结果:1)通过对MKN1和HGC-27细胞株进行功能基因组筛选,共分别得到137个和204个shRNA表达可重复表型的生长抑制基因,以及38个和156个shRNA表达可重复表型的生长促进基因。两个细胞株中有38个共同的生长抑制表型基因,其中包含ARSs家族中的DARS、KARS、VARS三个基因。2)通过GEPIA和Kaplan-Meier plotter数据库对ARSs家族的三个基因进行验证,可见DARS和VARS基因在胃癌中的表达水平均明显高于正常胃组织,而KARS的表达水平无显著差异。高表达的DARS和KARS基因表现出较差的总体生存期,而VARS的表达量高低与胃癌患者总体生存期无关。346例胃癌患者的内部组织微阵列分析DARS基因的组织蛋白表达水平,蛋白表达水平较强的有243例,表达相对较弱的有103例。临床病理特征分析得出DARS的蛋白高表达与T分期和淋巴结转移有关,且这种差异性体现在胃癌组织病理分型的肠型和弥漫型中。在基因工程小鼠的免疫组化分析中,相对于早期黏膜内癌,DARS在弥漫型的浸润癌中蛋白表达水平更强。3)通过RT-q PCR及Immunoblot实验发现DARS敲低后的mRNA水平及蛋白质表达水平均明显降低。两个胃癌细胞株中敲低的DARS基因抑制胃癌细胞的增殖能力、抑制胃癌细胞的克隆形成能力和迁移能力,导致胃癌细胞的G0/G1期阻滞,促进胃癌细胞的凋亡。4)小鼠异种移植模型中,DARS敲低的胃癌细胞在小鼠体内的生长能力受到抑制,相较于对照组,敲低组的小鼠肿瘤体积和重量均明显下降。小鼠肿瘤切片的HE染色提示DARS敲低后,胃癌细胞的有丝分裂能力明显降低。5)根据RNA高通量测序结果得出在MKN1细胞株中下调基因有340个,HGC-27细胞株中下调基因有277个,两者共有的下调基因有90个,两者共有的上调基因有38个。通过Immunoblot实验结果提示敲低DARS基因可抑制p-ERK1/2、p-CREB及p-ELK-1的表达,提示DARS基因可能通过调控Ca2+/MAPK/CREB/ELK-1信号通路影响胃癌的发生发展。小鼠肿瘤切片的免疫组化结果提示DARS和p-ERK1/2蛋白阳性表达水平在DARS基因敲低组细胞中明显降低。结论:1)DARS、KARS、VARS是本研究筛选出的治疗胃癌的候选靶基因。2)DARS在临床胃癌组织样本中的蛋白高表达水平与胃癌的T分期和淋巴结转移显著相关,且预后更差,尤其在弥漫型胃癌中。3)DARS基因敲低可抑制胃癌细胞的增殖、抑制胃癌细胞的克隆形成能力和迁移能力、阻滞胃癌细胞周期的G0/G1期、促进胃癌细胞的凋亡,并在异种移植肿瘤中抑制胃癌的生长和胃癌细胞的有丝分裂过程。4)DARS基因可能通过调控Ca2+/MAPK/CREB/ELK-1信号通路影响胃癌的发生发展。