【摘 要】
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研究背景:前列腺癌（prostate cancer,PCa）在男性癌症新发病例中排名第一,约有90.1%的前列腺癌患者和死亡男性被诊断为骨转移。外泌体是大小为30-150nm,由细胞分泌并释放细胞外囊泡,其中含有大量的蛋白质、DNA、mRNAs和microRNAs（miRNAs）等分子。研究表明,外泌体在前列腺癌的骨转移中,外泌体也起到了疾病发生发展的关键作用。正常情况下,骨骼的动态平衡主要是由成
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研究背景:前列腺癌（prostate cancer,PCa）在男性癌症新发病例中排名第一,约有90.1%的前列腺癌患者和死亡男性被诊断为骨转移。外泌体是大小为30-150nm,由细胞分泌并释放细胞外囊泡,其中含有大量的蛋白质、DNA、mRNAs和microRNAs（miRNAs）等分子。研究表明,外泌体在前列腺癌的骨转移中,外泌体也起到了疾病发生发展的关键作用。正常情况下,骨骼的动态平衡主要是由成骨细胞和破骨细胞之间的平衡活动所形成的。在癌症骨转移中,骨质平衡发生明显破坏,许多研究表明前列腺癌骨转移主要是成骨反应,而且其中前列腺癌细胞分泌的外泌体中的miRNA可能在骨转移中起着重要的调控作用。MiRNAs是一种内源性的约22个长度的RNAs,近些年来,许多实验研究已经明确,miR-214-3p对成骨分化有着明显的抑制作用。所以我们提出了猜想:前列腺癌骨转移是通过PCa分泌的外泌体中的miR-214-3p调控成骨细胞的分化水平而引起一系列成骨病理性改变。目前,对于PCa在骨转移中,其分泌的外泌体中的miR-214-3p对成骨细胞的机制仍尚不明确。研究目的:该研究在前列腺癌骨转移中,由PC-3细胞系分泌外泌体中的miR-214-3p对成骨细胞分化过程中的调控作用,或许能为临床治疗前列腺癌的骨转移提供新的治疗方法。研究方法:1.通过分别培养DU145、LNCap以及PC-3三株前列腺癌细胞系,收集上述细胞的培养液用超速离心法提取外泌体,用trizol法提取外泌体中的RNA,应用qRT-PCR测定各前列腺癌细胞系中的miR-214-3p含量。2.通过培养 PC-3 细胞系,用 lipo2000 将 miR-214-3p mimic、inhibitor 以及NC转染至细胞内,收集各组中培养液,用超速离心法从中分离提取外泌体。用透射电镜观察外泌体。3.抽取人骨髓,分离骨髓间充质干细胞,在诱导时加入miR-214-3pmimic、inhibitor、NC的PC-3外泌体及空白组于成骨培养液中,共同培养,每隔3天换液,诱导培养21天成熟的成骨细胞。用ALP染色、茜素红染色鉴定及观察成骨细胞的形态,用WB以及qRT-PCR等方法测定miR-214-3p、COL1A1以及OPN的基因表达水平,用WB验证Nothc1信号通路的变化情况。研究结果:1.DU145、LNCap以及PC-3三株前列腺癌细胞系外泌体中的miR-214-3p含量经过qRT-PCR测定并分析得出,PC-3前列腺癌细胞系中的miR-214-3p的含量较其他两组细胞系明显降低,说明前列腺癌骨转移细胞PC-3分泌的外泌体中miR-214-3p对成骨细胞有明显的调控。2.用透视电镜观察分离出来的PC-3前列腺癌细胞系外泌体,大多数外泌体为直径在40-110nm的脂质双层膜结构,电镜下呈现为凹陷型的“杯状”结构。3.将转染miR-214-3p mimic、inhibitor、NC的PC-3外泌体加入成骨细胞的诱导培养中,ALP、茜素红染色显示inhibitor组的成骨细胞分化与NC组相近,并且明显高于miR-214-3p mimic组及空白对照组。成骨细胞的分化标志COL1A1以及OPN基因水平呈相应结果,inhibitor成骨分化与NC组相近,并高于mimic组,同时Notchl通路相应被激活。结论:1.经过横向比较前列腺癌细胞系中的DU145、LNCap及PC-3,其中PC-3细胞系分泌的外泌体中的miR-214-3p水平较其他组明显减少。2.通过转染PC-3细胞系后,说明由PC-3分泌的外泌体中的miR-214-3p对成骨分化有着明显的增强作用,使成骨分化的相关标志基因alpha-1 typeⅠ collagen（COL1A1）以及 osteopontin（OPN）表达水平升高,激活了 Notch1信号通路。
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