随着宫颈癌患者的日趋年轻化及术后生存率的提高,改善患者术后生活质量已成为宫颈癌治疗的发展趋势。经典的宫颈癌根治术历经百余年的历史目前向保留器官生理功能的阶段发展,系统保留盆腔自主神经的根治性子宫切除术(Systematic Nerve-sparing radical hysterectomy,SNSRH)应势而生。SNSRH手术的经典术式是“Tokyo术式”,即“东京术式”,该术式术中保留神经的关键是对主韧带(Cardinal ligament,CL)的处理。由于Tokyo术式手术步骤繁琐,操作难度大,部分学者随后对其进行了改良。但不论是经典的Tokyo术式,还是其改良术式,术中主韧带中神经组织的保留主要依靠触觉、经验和解剖学标志,缺乏更详细的理论依据。主韧带组织学结构方面的研究,主要集中于苏木素(Hematoxylin)和伊红(Eosin)染色(简称HE染色)的研究,虽然HE染色能看出组织的基本结构,但对于组织的进一步分类不能区分。有学者对主韧带中的神经组织进行定性研究,但得出的结论相反。关于神经的定量研究,只有极少数学者进行研究,多局限于半定量水平,而且结果存在矛盾和争议。至于主韧带中重要组成成份如血管、淋巴管的定性定量研究未见文献报道。然而,神经、血管在主韧带中分布的位置对SNSRH手术至关重要。因此,目前对主韧带具有重要意义的组织结构基础研究不够深入,缺乏针对性的应用指标,对临床中存在的问题难以起到指导作用。鉴于此种情况,本课题收集Ⅲ型子宫切除术后的离体主韧带标本,详细进行标本切分,采用HE染色、免疫组织化学染色及特殊染色方法进行定性研究,以期阐明主韧带的精细显微组织结构特征。同时,利用生物体视学方法对主韧带各部、各段中的重要组成成份进行定量测定,提供量化数值。从而在微观水平,为临床提供主韧带的组织形态学实验数据。本研究分两部分进行,具体如下:第一部分主韧带精细显微组织结构的定性研究【目的】研究主韧带的精细显微组织结构特征。【方法】收集13例Ⅲ型子宫切除术后切除的主韧带标本22条,每条主韧带标本自宫颈附着处由里向外以1cm间距切分为3段,命名为近段、中段和远段,近段和中段各1cm,其余为远段,共66块组织。每块组织经10%福尔马林固定、常规石蜡包埋、切片4张,分别运用HE染色、免疫组织化学染色、特殊染色方法对主韧带各组织成份进行定性研究。【结果】1.HE染色结果:可见大量纤维结缔组织、脂肪组织;丰富的血管(包括中、小、微动静脉)、神经组织;散在淋巴管;偶见淋巴组织和淋巴结。2.免疫组织化学染色和特殊染色结果:1)纤维结缔组织:Masson氏三色染色法的改良法显示胶原纤维呈天蓝色至深蓝色,肌纤维呈红色;Unna氏地衣红染色技术显示弹力纤维为棕红色。主韧带中胶原纤维含量较多,弹力纤维和肌纤维很少,呈散在分布。2)神经组织:S-100抗体特异标记神经,证实主韧带中富含神经。改良的Loyes氏特殊染色显示神经髓鞘阴性,提示主韧带内的神经为自主神经。进一步用免疫组织化学染色区分神经类型,TH抗体特异标记交感神经结果阳性,VIP抗体特异标记副交感神经结果阳性,证明主韧带中的自主神经包括交感神经和副交感神经,还包括交感神经节和副交感神经节。主韧带中的神经较为丰富,呈散在分布,有一定的规律,相对集中于主韧带的下半部。3)血管:特异标记血管的CD34抗体免疫组化染色证实主韧带中存在动静脉,醛品红—高碘酸Schiff氏双染色改良法显示动脉为玫瑰红色。主韧带中的动静脉均较丰富,可以看到中小微动静脉,内含大量红细胞。分布相对集中于主韧带的上半部。4)淋巴管:特异标记淋巴管抗体D2-40免疫组化染色结果阳性,淋巴管呈散在分布,无明显规律,包括粗细不等的各级分支。【小结】主韧带中含大量纤维结缔组织,包括胶原纤维、弹力纤维和肌纤维,以胶原纤维为主;含大量脂肪组织;富含神经组织,为自主神经,包括交感神经和副交感神经以及交感神经节和副交感神经节,分布相对集中于主韧带的下半部;富含各级血管,主要集中于主韧带的上半部。淋巴管分布分散,包括各级淋巴管;偶见淋巴组织和淋巴结。第二部分子宫主韧带重要组成成份的生物体视学定量测定【目的】研究主韧带内的交感神经、副交感神经、血管及淋巴管的含量及其分布情况。【方法】1.主韧带分部:为方便描述和比较,将主韧带分为上半部和下半部。捞片时主韧带切片上缘(近心侧)均与玻片的上缘吻合。将玻片置于OLYMPUS BX51型号显微镜系统,在显微镜下找出玻片的上下缘,按照显微镜上的刻度值,于正中部位,将主韧带分为上半部和下半部。与前面取材的近、中、远分段共形成6个区间。2.图像采集:玻片置于OLYMPUS BX 51型号显微镜系统,在低倍镜下选择视野后转20倍下微调至图像清晰,再调至电脑显示的图像清晰后随机选择视野取图,每张玻片上下半部各随机取10个视野,共取20个视野。22条主韧带交感神经、副交感神经、血管和淋巴管各有玻片66张,因此,各指标分别采集图像1320张,共采集图像5280张。2.Imagepro图像分析:将采集的图像输入计算机,用Imagepro医学图像分析软件测试阳性观测指标面积,同时测每幅照片面积。3.体积密度计算:利用生物体视学公式,体积密度(Vv)=观测阳性指标的测试面积/参照空间面积,计算出各阳性指标的体积密度。4.统计学方法:所有数据应用SPSS13.0统计软件进行分析,P＜0.05认为差异有统计学意义。计量资料以均数±标准差((?)±s)表示,主韧带上下两半部各指标数据比较采用Independent-Samples T检验。主韧带上半部和下半部的近、中、远段以及主韧带近、中、远段间指标数据比较采用One-way ANOVA方差分析。【结果】(一)主韧带内的神经体积密度(Vv):1.主韧带内的交感神经体积密度(Vv):1)主韧带内的交感神经总体积密度为(0.0608±0.0620)2)上半部(0.0326+0.0431)和下半部(0.0890±0.0826),下半部交感神经体积密度高于上半部(t=-2.182,P=0.039)。3)近段(0.0637±0.0524)、中段(0.0886±0.0775)和远段(0.1098±0.1115),三段间交感神经体积密度无显著性差异(F=0.980,P=0.385)。4)上半部近段(0.0315±0.0452)和下半部近段(0.0617±0.0417),交感神经体积密度无显著性差异(t=1.766,P=0.09);上半部中段(0.0297±0.0577)和下半部中段(0.0968±0.0765),下半部交感神经体积密度高于上半部(t=-2.523,P=0.019);上半部远段(0.0367±0.0399)和下半部远段(0.1087+0.1519),交感神经体积密度无显著性差异(t=1.654,P=0.111);5)上半部近、中和远三段间交感神经体积密度无显著性差异(F=0.090,P=0.914);下半部近、中和远三段间交感神经体积密度无显著性差异(F=1.169,P=0.322)。2.主韧带内的副交感神经体积密度(Vv):1)主韧带内副交感神经总体积密度为(0.0225±0.0126).2)上半部(0.0092±0.0081)和下半部(0.0578±0.0419),下半部副交感神经体积密度高于上半部(t=-3.935,P=0.002)。3)近段(0.0349±0.0305)、中段(0.0357±0.0334)和远段(0.0640±0.0392),三段间副交感神经体积密度无显著性差异(F=2.756,P=0.078)。4)上半部近段(0.0091±0.0124)和下半部近段(0.0448±0.0347),下半部副交感神经体积密度高于上半部(t=-3.350,P=0.005);上半部中段(0.0048±0.0070)和下半部中段(0.0504±0.0482),下半部副交感神经体积密度高于上半部(t=-3.246,P=0.007);上半部远段(0.0105±0.0132)和下半部远段(0.0815±0.0631),下半部副交感神经体积密度高于上半部(t=-3.811,P=0.002);5)上半部近、中、远三段间副交感神经体积密度无显著性差异(F=1.239,P=0.203);下半部近、中、远三段间副交感神经体积密度有显著性差异(F=3.724,P=0.035):下半部远段副交感神经体积密度高于近段(P=0.018);下半部远段副交感神经体积密度高于中段(P=0.035)。3.主韧带内交感神经和副交感神经的比例为2.8:1。(二)主韧带内的血管体积密度(Vv):1)主韧带内血管总体积密度(0.1424±0.1030)。2)上半部(0.2153±0.0992)和下半部(0.0696±0.0275);上半部血管体积密度高于下半部(t=5.104,P=0.000)。3)近段(0.1729±0.1100)、中段(0.1843±0.1119)和远段(0.1767±0.0770),三段间血管体积密度无显著性差异(F=0.043,P=0.958)。4)上半部近段(0.2289±0.1837)和下半部近段(0.0538±0.0399),上半部血管积密度高于下半部(t=3.358,P=0.005);上半部中段(0.2137±0.1504)和下半部中段(0.0765±0.0441),上半部血管体积密度高于下半部(t=3.157,P=0.007);上半部远段(0.2034±0.0756)和下半部远段(0.0784±0.0443),上半部血管体积密度高于下半部(t=5.144,P=0.000);5)上半部近、中、远三段间血管体积密度无显著性差异(F=0.103,P=0.902):下半部近、中、远三段组间血管体积密度无显著性差异(F=1.327,P=0.278)。(三)主韧带内的淋巴管体积密度(Vv):1)主韧带内的淋巴管总体积密度(0.0050±0.0049)。2)上半部(0.0067±0.0056)和下半部(0.0033±0.0035),两部间淋巴管体积密度无显著性差异(t=1.798,P=0.089)。3)近段(0.0054±0.0062)、中段(0.0044±0.0054)和远段(0.0077±0.0085),三段间淋巴管体积密度无显著性差异(F=0.762,P=0.475)。4)上半部近段(0.0065±0.0084)和下半部近段(0.0030±0.0043),淋巴管体积密度无显著性差异(t=1.282,P=0.213);上半部中段(0.0044±0.0063)和下半部中段(0.0031±0.0042),淋巴管体积密度无显著性差异(t=0.606,P=0.550);上半部远段(0.0093±0.0019)和下半部远段(0.0039±0.0060),淋巴管体积密度无显著性差异(t=1.404,P=0.174);5)上半部近、中、远三段间淋巴管体积密度无显著性差异(F=0.842,P=0.440);下半部近、中、远三段间淋巴管体积密度无显著性差异(F=0.116,P=0.891)。【小结】(一)自主神经的分布:1.交感神经的分布:①下半部＞上半部(P=0.039);②中段:下半部＞上半部(P=0.019);③下半部由近及远有增高趋势。2.副交感神经的分布:①下半部＞上半部(P=0.002);②呈下半部远段最多,中段次之,近段最少分布规律。3.交感神经和副交感神经的比例为2.8:1。(二)血管的分布:①上半部＞下半部(P=0.000);②中小细血管均有;③近段、中段、远段分布无规律。(三)淋巴管的分布:存在于主韧带各部各段,分布无规律。(四)我们的研究结果支持将主韧带分为血管部和神经部。(五)根据我们的研究结果证实主韧带切除越长,切除的神经越多。