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目的:蛋白酶激活受体-2(Proteinase-actived receptors 2,PAR-2)是一种细胞膜表面受体,为G蛋白相耦联的蛋白酶激活受体超家族成员之一。PAR-2在各个系统及组织中广泛表达,胰蛋白酶、纤溶酶、凝血因子VIIa和Xa等是其内源性激活肽,也可被人工合成的PAR-2选择性激动剂SLIGKV-NH2激活。国内外大量研究表明,PAR-2与消化系统肿瘤密切相关,表达强度显著高于正常组织细胞,可促进肿瘤的增殖、侵袭和转移。胰腺癌是预后极差的消化系统恶性肿瘤,由于它的高侵袭性和高转移率,手术治疗难度大,且淋巴转移迅速,发病率几乎等于死亡率。研究发现,PAR-2在胰腺癌组织中高表达,可促进多种胰腺癌细胞的增殖,还可加速裸鼠皮下移植胰腺肿瘤的增长和转移。正常胰腺腺泡和胰腺癌细胞均可可分泌胰蛋白酶原,胰蛋白酶原激活后成为胰蛋白酶,而胰蛋白酶却是PAR-2最有效的激动剂,说明PAR-2很可能与胰腺癌有着密切的关系。迄今为止,国内外对于PAR-2促进胰腺癌侵袭转移机制的研究鲜见报道,而PAR-2促进胰腺癌血管生成和淋巴转移方面的研究大多还处于在体研究阶段。本研究我们采用侵袭转移能力较强的人胰腺癌细胞株SW1990为靶细胞,初步探讨PAR-2促进胰腺癌侵袭和转移的可能的分子机制。方法:RT-PCR法和免疫细胞化学染色法检测SW1990细胞中PAR-2 mRNA及蛋白的表达情况。绘制SW1990细胞生长曲线,MTT法检测胰蛋白酶和PAR-2激动肽SLIGKV作用前后SW1990细胞增殖情况,并确定合适的各药物浓度和作用时间。流式细胞术(FCM)检测各实验组细胞周期分布。Transwell小室法检测各组细胞侵袭和迁移能力。RT-PCR法检测胰药物作用前后MMP-2、MMP-9、VEGF-A、VEGF-C、IL-8 mRNA表达的变化。明胶酶谱法检测胰蛋白酶和SLIGKV作用细胞前后MMP-2、MMP-9明胶酶活性的变化。ELISA法检测药物干预SW1990细胞8h、16h、24h、32h后分别收集各实验组细胞上清液,检测各组细胞相对应的各个时间段上清液中VEGF-A、VEGF-C及IL-8的蛋白含量变化。结果:PAR-2在胰腺癌细胞SW1990细胞中高表达。1 RT-PCR法检测PAR-2 mRNA表达:结果显示SW1990细胞在基因水平表达PAR-2。且发现PAR-2激动肽SLIGKV及胰蛋白酶作用SW1990细胞24h后发现,PAR-2mRNA表达量分别为(0.645±0.038)、(0.612±0.042)vs对照组(0.391±0.022)显著增高(P<0.05),但PAR-2反激动肽VKGILS组PAR-2 mRNA表达量为(0.413±0.040),与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。2免疫细胞化学染色法结果显示,SW1990细胞与抗PAR-2多克隆抗体有很强的结合反应。PAR-2蛋白表现为棕黄色,着色主要在胞膜和胞浆,与PAR-2在细胞中的结构相符合。PAR-2激动剂对胰腺癌细胞SW1990增殖的影响1细胞计数试验及MTT法检测PAR-2激活后对SW1990细胞增殖的影响。结果发现一定时间范围内,SLIGKV在1-50μmol/L、胰蛋白酶在1-10 nmol/L浓度范围内胰腺癌细胞的增殖与药物浓度呈正相关。当药物浓度一定时,在1-56 h时间范围内,胰腺癌细胞增殖与作用时间也呈正相关,且呈时间依赖性。而VKGILS始终对SW1990细胞增殖则无明显影响。2流式细胞术检测细胞周期分布变化:10nmol/L浓度的胰蛋白酶及50umol/LSLIGKV组促进SW1990细胞细胞周期比例重新分布,加速细胞周期,其中使S期和G2/M细胞增多、使G0/G1细胞减少,对照组相比有显著差异(P<0.05)。而VKGILS无此作用。PAR-2激动剂促进胰腺癌细胞SW1990侵袭与转移。1 Transwell小室试验检测SW1990细胞侵袭及迁移能力:在迁移试验中,一定浓度的胰蛋白酶及SLIGKV作用相同时间后发现,SW1990细胞经变形运动通过微孔膜的细胞数明显多于对照组与反激动肽组(100.8±12.9)(89.6±10.9) vs (43.3±9.2)(50.1±7.5),(P<0.01)。细胞侵袭试验发现,药物干预后SW1990细胞降解Matrigel基质胶,进入微孔膜内的细胞数胰蛋白酶及SLIGKV也显著高于对照组及VKGILS组,(81.5±8.1) (71.7±5.2) vs (28.3±5.6) (32.2±7.8),(P<0.01)。2 RT-PCR 10nmol/L的胰蛋白酶及50nmol/L的SLIGKV作用24h后检测细胞MMP-2、VEGF-A、VEGF-C、IL-8 mRNA的表达量分别明显高于对照组,具有显著统计学意义,而MMP-9表达无明显变化。3明胶酶谱检测MMP-2、MMP-9的明胶酶活性变化:结果显示一定浓度的胰蛋白酶及SLIGKV作用后细胞MMP-2活性明显高于对照组及反激动肽组(0.921±0.032)(0.712±0.024)vs (0.310±0.038) (0.378±0.029),(P<0.01),而MMP-9的活性无明显变化,这与RT-PCR结果一致,(P>0.05)。4 ELISA法检测药物干预8h,16h,24h,32h后,收集各时间点各组细胞上清液中VEGF-A、VEGF-C及IL-8蛋白含量变化,发现各时间点胰蛋白酶组及SLIGKV组三者蛋白含量均高于对照组,(P<0.05),且呈一定的时间依赖性。结论:1胰腺癌细胞SW1990在基因及蛋白水平均表达PAR-2受体,且PAR-2激动剂可在基因水平上调其表达。2 PAR-2激动剂可促进胰腺癌细胞SW1990增殖,在一定时间和浓度范围内呈现浓度-时间依赖性,并且其促增殖作用和加速细胞周期进程有关。3 PAR-2激动剂可促进胰腺癌细胞SW1990浸润和迁移,可能与上调细胞MMP-2mRNA表达,增强MMP-2明胶酶活性有关,而与MMP-9无关。4 PAR-2激动剂可上调胰腺癌细胞SW1990中VEGF-A、VEGF-C及IL-8mRNA表达,并可促进其分泌VEGF-A、VEGF-C及IL-8,可能促进胰腺癌血管形成。5 PAR-2激动剂可上调胰腺癌细胞SW1990中VEGF-A、VEGF-CmRNA的表达,并可促进其分泌VEGF-A、VEGF-C,因此可能促进胰腺癌淋巴管形成和淋巴转移。