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背景胃癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率和病死率都非常高。胃癌的侵袭转移和术后复发是大多数胃癌患者死亡的主要原因。上皮一间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)为上皮来源的肿瘤细胞提供了侵袭转移基础,EMT是诱发肿瘤浸润和转移的早期关键事件,EMT在恶性肿瘤侵袭转移中的作用成为研究焦点。研究胃癌侵袭和EMT的发生机制,有利于寻找治疗靶点。多种信号转导通路参与了肿瘤细胞的EMT过程,包括转化生长因子-β(TGF-β)、 MAPK、Notch及Wnt信号通路等。其中Wnt/β-catenin信号通路异常激活,使肿瘤细胞间的粘附力减弱,诱导肿瘤细胞的EMT过程,从而增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。Eph基因家族是目前已知受体酪氨酸激酶(RTKs)中最大的亚族,具有受体酪氨酸激酶的活性,在调控肿瘤细胞生长、增殖、转移相关的信号转导通路中起关键作用。EphA2受体是已经发现的14种Eph受体中的一员,在多种肿瘤中高表达。最近研究发现EphA2与EMT有关,但机制尚不清楚。深入探讨EphA2调控胃癌EMT的机制,对指导胃癌的术后治疗具有非常重要的意义。目的探讨EphA2在胃癌EMT中的作用及其机制。方法1.采用免疫组织化学的方法检测158例胃癌组织和癌旁非癌胃粘膜组织中EphA2和EMT相关标志物E-cadherin、β-catenin和vimentin的表达,分析与临床病理特征和预后的关系；采用实时定量逆转录聚合酶链式反应(real time RT-PCR)检测胃癌细胞中EphA2mRNA的表达。2.应用Wnt/β-catenin通路激活剂氯化锂(Lithium chloride, LiC1)作用胃癌AGS细胞后,噻唑蓝法(MTT)观察细胞增殖情况,Western blot方法检测GSK-3β和磷酸化GSK-3βSer9的表达,免疫荧光法检测β-catenin的表达部位,real time RT-PCR和Western blot方法检测Wnt/(3-catenin通路靶基因c-myc mRNA和蛋白的表达,以此检测Wnt/β-catenin通路的激活情况。3.采用EphA2siRNA转染胃癌AGS细胞,real time RT-PCR和Western blot检测EphA2mRNA和蛋白的表达；然后用LiCl+EphA2siRNA共同作用胃癌AGS细胞,检测Wnt/β-catenin通路相关因子的变化。4. LiCl诱导胃癌AGS细胞EMT, real time RT-PCR和Western blot检测EMT相关标志物E-cadherin、β-catenin和vimentin的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期,Transwell小室检测细胞侵袭力的变化；EphA2siRNA沉默胃癌AGS细胞EphA2表达后,real time RT-PCR和Western blot检测EMT相关标志物E-cadherin、 β-catenin、vimentin和c-myc的表达,流式细胞仪检测各组细胞周期,Transwell小室侵袭实验观察各组细胞侵袭情况；LiCl+EphA2siRNA共同作用胃癌AGS细胞,real time RT-PCR和Western blot检测EMT相关标志物E-cadherin、β-catenin和vimentin的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期,Transwell小室检测细胞侵袭力的变化。结果1.与癌旁非癌胃粘膜组织相比,胃癌组织中EphA2和vimentin明显高表达(P<0.01),E-cadherin明显低表达(P<0.01),β-catenin核表达明显增多(P<0.01)；胃癌组织中EphA2高表达与胃癌的浸润深度、TNM分期以及淋巴结转移数有关(P<0.05),E-cadherin的表达强弱与胃癌的分化程度、浸润深度、TNM分期和淋巴结转移数有关(P<0.05),β-catenin的核表达与胃癌的分化程度、浸润深度、TNM分期和有无淋巴结转移有关(P<0.05),vimentin的表达强弱与胃癌的分化程度、浸润深度、TNM分期和有无淋巴结转移有关(P<0.05)；EphA2与E-cadherin的表达呈负相关(r=-0.625,P<0.01),与β-catenin的核表达呈正相关(r=0.375,P<0.01),与vimentin的表达呈正相关(r=0.330,P<0.01)；单因素分析EphA2高表达、E-cadherin低表达、β-catenin核表达、vimentin高表达组5年生存率明显降低(P<0.05)；Cox多因素分析显示EphA2高表达、E-cadherin低表达、β-catenin核表达和vimentin表达是影响预后的独立因素。2.不同浓度LiCl处理胃癌AGS细胞不同时间后,对细胞的增殖差异有统计学意义P<0.05),以20mmol/L LiCl作用24小时对胃癌细胞增殖的促进最明显(P<0.05)。LiCl能明显上调胃癌AGS细胞磷酸化GSK-3βSer9蛋白的表达(P<0.05),增加胃癌AGS细胞β-catenin发生核转移的细胞数(P<0.05),上调c-myc mRNA和蛋白的表达p<0.05)。3. EphA2siRNA能明显抑制胃癌AGS细胞EphA2mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。EphA2siRNA能明显抑制LiCl引起的磷酸化GSK-3βSer9蛋白表达上调、β-catenin核转移细胞数增多和c-myc mRNA、蛋白表达上调(P<0.05)。4. LiCl组E-cadherin mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05),β-catenin mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.05),vimentin mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.05),G0/G1期细胞明显减少(P<0.05),S期、G2/M期细胞明显增多(P<0.05),侵袭细胞数明显增多(P<0.05)；EphA2siRNA转染组E-cadherin mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.05),β-catenin和vimentin mRNA和蛋白的表达明显下调(P<0.05),G0/G1期细胞明显增多(P<0.05),S期、G2/M期细胞明显减少(P<0.05),侵袭细胞数明显减少(P<0.05)；LiCl+EphA2siRNA组较单用LiCl组E-cadherin mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.05),β-catenin和vimentin mRNA和蛋白的表达明显下调(P<0.05),G0/G1期细胞明显增多(P<0.05),S期、G2/M期细胞明显减少(P<0.05),侵袭细胞数明显减少(P<0.05)。结论1.胃癌组织中EphA2和EMT相关标志物的表达与胃癌的进展和侵袭转移密切相关,可作为判断胃癌患者预后的指标；侵袭性强的胃癌AGS细胞中EphA2呈高表达。2. EphA2siRNA能抑制LiCl对胃癌AGS细胞Wnt/p-catenin信号通路的激活。3. EphA2siRNA能够逆转LiCl诱导的胃癌AGS细胞EMT,降低发生了EMT的胃癌AGS细胞的侵袭力。