近些年来，根据本实验室对临床分离的H9N2毒株研究发现，部分分离株对鸡和鸡胚的致病性显著增强，本试验选取了两株致病力不同但遗传背景较相似的H9N2亚型流感病毒为研究对象，利用反向遗传技术及定点突变技术，旨在发现导致H9N2亚型禽流感病毒致病力差异的基因片段和关键氨基酸位点，从而揭示导致H9N2亚型禽流感病毒毒力增强的分子基础，为流感的防控提供参考和依据。试验一两株不同致病力H9N2禽流感病毒的8质粒转录/表达载体的构建及病毒拯救　　为建立强弱致病力H9N2亚型流感病毒的8质粒转录/表达载体的构建，本研究对A/chicken/Shandong/818/2010（H9N2）(SD/818)和A/chicken/Shandong/196/2011(H9N2)(SD/196)两株致病力存在明显差异的野生型H9N2亚型禽流感病毒，进行了全基因组序列扩增，并将其全部克隆于PHW2000双向转录/表达载体，PCR鉴定后，将其各个片段的表达质粒进行测序，结果与野生毒株序列完全一致，即已成功构建了两套8质粒表达质粒，为成功拯救病毒奠定了基础。经测序验证后，分别将两套质粒转入293T细胞，拯救出两株具有血凝活性的毒株，经鉴定为H9N2亚型病毒。对拯救毒株进行全基因组测序验证后，结果表明拯救出的毒株与两株野生型病毒的核苷酸序列完全一致；体外试验证明：拯救毒株与野生毒株在鸡胚和细胞中的复制能力一致；动物试验证明：拯救毒株保持了野生型毒株对鸡和鸡胚的致病力。这两套反向遗传操作系统的构建，为研究H9N2亚型毒株对禽类致病性的分子致病机制奠定了基础。　　试验二通过反向遗传技术产生多个H9N2重组流感病毒　　为研究H9N2毒株致病力增强的分子机制，本研究从本实验室2007-2013年分离并保存的部分H9N2亚型毒株中选取了一对致病力存在明显差异、且基因组差异相对较小的毒株，通过反向遗传技术成功构建了两套反向遗传操作系统。运用这两套H9N2亚型禽流感反向遗传质粒系统，将两株病毒的基因进行重组，成功地构建了多个H9N2重组流感病毒，通过EID50、ELD50、IVPI测定对鸡胚及鸡的致病力情况。结果发现以SD/196为骨架替换的SD/818株的HA和NS片段，对鸡和鸡胚的致病力明显增强，可初步认为，HA和NS片段上的某些位点与流感病毒的致病力相关，而具体的位点还需进一步探究。　　试验三利用反向遗传技术产生HA、NS片段单位点突变的重组H9亚型病毒　　为了找到与致病力相关的关键氨基酸位点，我们对 HA、NS片段进行序列比较，结果发现HA上有9个氨基酸位点和NS上有4个氨基酸位点在在致病力不同的毒株上有差异。本研究利用反向遗传操作技术，以 SD/196的 HA和NS基因组为模板，设计引物HAmut和NSmut，通过两步PCR扩增出全长HAmut和NSmut序列，利用反向遗传技术将其克隆于PHW2000双向转录/表达载体，成功构建的突变质粒与 SD/196株的其他质粒共转染293T细胞，旨在发现其致病的潜在氨基酸位点。结果表明，本实验已成功构建了4个HA和4个NS突变质粒，通过细胞转染技术未能成功拯救出突变的重组病毒，具体原因还需进一步验证。