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早在一个世纪以前,就有研究者利用细菌提取物刺激肿瘤免疫应答,随后又有研究者用小棒状杆菌和BCG治疗肿瘤,所以刺激机体免疫系统控制恶性肿瘤已经不是一种新的方法,与传统的化疗,放疗和生物治疗相比较,肿瘤免疫治疗诱导自身的肿瘤特异性免疫应答,不但可以识别,清除和破坏原发和继发的肿瘤细胞,而且对机体没有毒副作用,强的免疫应答还可以建立免疫记忆,阻止肿瘤的复发.所以近年来,免疫治疗在恶性肿瘤治疗中备受青睐,并且随着分子免疫学和细胞免疫学的发展,以及我们对肿瘤与宿主间相互关系的理解逐渐增多,认识到免疫应答是通过肿瘤相关性抗原(TAAs)认识肿瘤的,因此基于"肿瘤相关性抗原(TAAs)"的肿瘤治疗性疫苗更显现出它的优越性.女性恶性肿瘤中,乳腺癌发病率已经上升到第一位.由于大多数患者在疾病诊断初期既有微转移,所以乳腺癌手术,化疗,放疗结合激素替代综合治疗仍不能控制它高达30%的复发率,而免疫治疗在乳腺癌术后辅助治疗中已经初见成效,尤其是以 TAAs为靶标设计肿瘤治疗性疫苗.近年来发现了大量的乳腺癌相关抗原:her2/neu,MUC-1,P53,NY-ESO-1,MAGE-1,MAGE-3,SCP-1,CT-7等等,在乳腺癌患者中发现有这些抗原的特异性的抗体和细胞毒性T淋巴细胞,为乳腺癌免疫治疗奠定了基础,但是这些抗原在乳腺癌中的表达率均较低,仅为20%-40%,针对这些抗原肿瘤疫苗仅适合于少部分人群,而且部分抗原的表达并不局限于乳腺癌,在其他细胞中也有表达,以此为靶标的疫苗不能保证其安全性,因此本研究拟鉴定乳腺癌高度限制性高表达的抗原,并研究其免疫原性.NY-BR-1是2001年Dr Jager和同事应用SEREX(血清分析cDNA表达文库)技术,利用一乳腺癌患者的血清分析乳腺癌细胞cDNA文库发现的乳腺癌分化抗原,位于染色体10p11.21-12.1,含37个外显子,编码的蛋白由1341个氨基酸残基组成,其mRNA 仅在乳腺和睾丸组织中表达,患者体内特异性的高滴度抗体IgG的产生证明NY-BR-1的乳腺特异性是在蛋白和细胞水平,其限制性表达和患者体内高滴度的IgG使之可望<WP=9>成为乳腺癌免疫治疗的靶标,所以本研究首先用RT-PCR检测分化抗原NY-BR-1在中国乳腺癌患者中的表达情况,检测34例乳腺癌标本和三株乳腺癌细胞系后发现,NY-BR-1在26例乳腺癌标本和2例乳腺癌细胞系中均有表达,所以NY-BR-1可以作为乳腺癌治疗性疫苗的一种有效靶标,本课题拟对其免疫原性作进一步研究.结合量化基序法和多项式法预测方案分析预测NY-BR-1的HLA-A2制性表位多肽,选择其中评分最高的三个表位肽MLLQQNVDV(167～175)(307.98),YLLHENCML(1043～1051)(100.32),NMWLQQQLV(1274～1282)(358.11)作进一步的分子模拟和与HLA-A2亲和力的研究,经计算机模拟与分子动力学[7]计算显示,三个候选表位肽均能与HLA-A2分子结合,锚点残基的距离均在15-20埃之间,各候选肽与阳性肽具有相似的非键能,氢键数符合HLA-A2限制性CTL表位的要求,采用标准Fmoc方案在多肽合成仪ABI431A型上进行,多肽-树脂复合物的切割采用三氟乙酸合成候选肽,并用中压液相色谱仪纯化,反相高压液相色谱仪(RP-HPLC)鉴定纯度.候选肽与HLA-A2的亲和力进一步用T2细胞的结合实验验证,结果以荧光系数(FI)作为检测指标(FI=(候选肽的MFI-背景MFI)/背景MFI),各肽的荧光系数分别为,阳性肽MAGE,MLLQQNVDV(167～175)(1.444),YLLHENCML(1043～1051)(1.383),NMWLQQQLV(1274～1282)(1.506),三个候选肽均与HLA-A2也有较高的亲和力.运用Elispot和标准的51Cr释放实验对候选肽在体外的免疫原性进行研究,ELISPOT检测HLA-A2阳性的健康人外周血单个核细胞(PBMC)是否有候选肽特异性的T淋巴细胞,候选肽能否将它激活,而标准的51Cr释放实验则检测激活的特异性CTL能否有效杀伤NY-BR-1和HLA-A2均表达阳性的乳腺癌细胞系SK-BR-3,证明候选肽是不是肿瘤细胞天然呈递的HLA-A2限制性的CTL表位.实验结果证明,正常人外周血中有候选肽MLLQQNVDV(167～175)和NMWLQQQLV(1274～1282)的CTL前体细胞,活化的CTL均可有效杀伤靶细胞,当效:靶为50:1 MLLQQNVDV(167～175)刺激PBMC对MCF-7的杀伤率为42.3%,其次为NMWLQQQLV(1274～1282)杀伤率为20.8%,而YLLHENCML(1043～1051)则并没有产生特异性杀伤.综上所述,候选肽 MLLQQNVDV(167～175)和NMWLQQQLV(1274～1282)是 NY-BR-1的HLA-A2限制性的CTL表位.分化抗原NY-BR-1是用SEREX技术鉴定的,乳腺癌患者体内有较高滴度的IgG抗体,仅在乳腺组织和睾丸组织表达,乳腺癌中表达率约为80%,正常人体内发现有其表位肽特异性的前体细胞,而且激活后可以杀伤抗原表达阳性的肿瘤细胞,因此分化抗原NY-BR-1可能成为乳腺癌治疗的有效靶标,但是在体是否能够有效的激活肿瘤抗原特异性的CTL,能否使肿瘤消退,以及是否会激活自身免疫应答等问题的研究将在本人申请的自然科学基金课题工作中继续进行.