【摘 要】
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目的:探讨铜绿假单胞菌分泌蛋白Pec1对肺巨噬细胞吞噬功能的影响效应及其可能机制,旨在阐明铜绿假单胞菌在抵抗宿主免疫防御体系过程中的分子基础,为临床治疗铜绿假单胞菌感染提供理论基础。方法:通过NCBI提供的PAO1序列库设计pec1引物,扩增PCR产物,构建重组p MD19-T-pec1质粒和重组p ET-30a-pec1质粒,原核表达、纯化并提取重组Pec1蛋白,SDS-PAGE和Western
【基金项目】
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国家自然科研基金委员会（81870009）
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目的:探讨铜绿假单胞菌分泌蛋白Pec1对肺巨噬细胞吞噬功能的影响效应及其可能机制,旨在阐明铜绿假单胞菌在抵抗宿主免疫防御体系过程中的分子基础,为临床治疗铜绿假单胞菌感染提供理论基础。方法:通过NCBI提供的PAO1序列库设计pec1引物,扩增PCR产物,构建重组p MD19-T-pec1质粒和重组p ET-30a-pec1质粒,原核表达、纯化并提取重组Pec1蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定Pec1蛋白表达。CCK-8法检测Pec1蛋白对小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S细胞增殖的影响;中性红及镜下观察法分别检测Pec1蛋白刺激MH-S细胞后对中性红及灭活铜绿假单胞菌标准菌株PAO1吞噬功能的影响;菌落计数法检测并比较MH-S对PAO1和PAO1敲除株△pec1吞噬效率的差异;Western blot法检测MH-S细胞在Pec1蛋白刺激后TLR4表达、PI3K及Akt的磷酸化水平。采用气管注射法,分别构建PAO1株及△pec1株感染大鼠肺炎模型,HE染色观察并比较各组大鼠肺部炎症状况、免疫荧光双重染色法观察并运用image J软件半定量比较各组大鼠肺内巨噬细胞TLR4表达、PI3K及Akt磷酸化水平,对各组肺组织进行菌落培养计数,统计并比较各组大鼠肺内细菌的清除水平。结果:1.经PCR扩增的pec1全长基因约828 bp,成功构建重组质粒p MD19-T-pec1和原核表达载体p ET-30a-pec1并表达纯化出Pec1蛋白,Pec1蛋白分子量大小约为30.5 k Da。2.Pec1对MH-S细胞的增殖抑制作用在72 h内既呈时-效关系也呈量-效关系。3.Pec1在40、80及120μg/m L下,既可对MH-S细胞吞噬中性红产生抑制作用（P<0.01）,也可对其吞噬PAO1灭活菌产生抑制效应,且对它们的抑制效应皆随浓度增加而增强（P<0.001）;与△pec1组相比,MH-S细胞对PAO1的吞噬量显著减少（P<0.001）,且对PAO1的细菌清除率也明显降低（P<0.001）（两组MOI=10）。4.与对照组相比,Pec1刺激MH-S细胞后,PI3K及Akt磷酸化水平、TLR4表达水平均显著下降（P<0.05）。PI3K/Akt激动剂不但能逆转Pec1对MH-S细胞吞噬中性红的抑制效应（P<0.001）,且可恢复MH-S细胞对PAO1吞噬量减少的现象（P<0.001）;TLR4激动剂可抵消Pec1预处理所引起的MH-S细胞TLR4表达下降、PI3K及Akt磷酸化水平的抑制作用（P<0.01）,提高对中性红的吞噬作用（P<0.001）及对PAO1的吞噬能力（P<0.001）。5.以PA菌感染大鼠构建肺炎模型,大体标本可见PAO1组肺呈暗红色、明显充血肿大,而△pec1组大鼠肺呈淡红色、轻度充血肿大;肺组织HE染色显示,PAO1组可见肺泡内大量炎性细胞渗出,肺泡结构明显破坏,而△pec1组肺泡内炎性细胞渗出相对较少、肺泡结构相对完整;两组炎症面积半定量比较显示,△pec1组炎症相对较轻（P<0.05）;免疫荧光双重染色显示,与△pec1组相比,PAO1组肺巨噬细胞TLR4总水平、PI3K和Akt磷酸化水平均明显下降（P<0.05）;感染2周后,肺组织菌落计数结果示,PAO1组显著高于△pec1组（P<0.05）,即PAO1组细菌清除率更低（P<0.01）。结论:1.成功构建原核表达载体p ET-30a-pec1并表达纯化Pec1蛋白;2.Pec1对MH-S细胞的增殖有抑制作用;3.Pec1可抑制肺巨噬细胞对PA的吞噬清除功能,其机制可能与下调TLR4/PI3K/Akt信号通路有关。
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