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背景:Ras 相关的 C3 肉毒素底物 1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)是Rho家族小G蛋白成员之一,在细胞粘附,增殖以及细胞骨架调节等一系列细胞生理活动中发挥重要作用。过度激活的Rac1参与氧化应激以及炎症反应等病理过程,与糖尿病肾病的发病及病情发展密切相关。研究表明,在一定损伤下足细胞可能通过上皮-间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)这一机制发生表型转化,导致足细胞结构与功能紊乱、肾小球滤过膜的破坏以及蛋白尿的发生。而Rac1可能通过活化p21活化激酶1(p21-activated kinase 1,PAK1)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)等下游重要的效应激酶参与肿瘤细胞EMT过程。P38MAPK为MAPK家族成员之一,参与产生炎症介质及调节细胞骨架稳定性。本课题组前期研究发现,高糖环境可通过激活p38 MAPK诱导肾小管上皮细胞发生EMT,参与糖尿病肾病肾脏纤维化的发生发展,而靶向p38MAPK的重组质粒可有效干扰p38MAPK基因表达,阻断EMT的发生。因此,本研究以条件永生化小鼠足细胞系及构建足细胞特异性Rac1 RNAi转基因小鼠(transgenic mice,TGmice)作为研究对象,观察并探讨Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路的激活在高糖刺激诱导的足细胞EMT及糖尿病肾病蛋白尿发生过程中的作用机制,Rac1信号通路与EMT中重要转录因子β-连环蛋白(β-catenin)的相互关系,以及靶向抑制足细胞Rac1活性水平对糖尿病肾病足细胞损伤以及蛋白尿的保护作用,为临床早期预防和治疗糖尿病肾病提供新的理论依据和新的思路。第一部分 Rac1在高糖诱导的足细胞上皮-间充质转分化中的作用机制目的:1.明确高糖环境是否导致足细胞发生EMT。2.明确足细胞发生EMT是否导致其功能障碍,影响其屏障功能。3.探讨Rac1信号通路参与高糖诱导的足细胞EMT的发生机制。4.探讨调控Rac1信号通路对高糖诱导的足细胞EMT的影响。方法:1.细胞培养:体外培养永生化小鼠足细胞系(由哈佛医学院Peter Mundel教授惠赠,北京大学丁洁教授转赠)。在Ⅰ型胶原包被的培养瓶内,在条件下,用RPMI 1640(10%胎牛血清)+10 U/ml重组小鼠γ-干扰素,于33℃C培养足细胞增殖;用不含γ-干扰素培养基37℃C培养足细胞14天促进其分化成熟。2.检测高糖(30mmol/l)刺激前后足细胞EMT指标及足细胞功能:(1)倒置相差显微镜明确足细胞形态学是否变化;(2)western blot、real time PCR及细胞免疫荧光检测足细胞标志蛋白p-cadherin、ZO-1及间充质细胞样表型标志物FSP-1、α-SMA、desmin的表达变化;(3)流式细胞术检测高糖培养条件下足细胞凋亡情况;(4)Transwell小室检测白蛋白流入量,评价足细胞的单层屏障功能;(5)Transwell检测足细胞迁移率以及FITC-鬼笔环肽(FITC-phalloidin)染色鉴定足细胞F-actin细胞骨架变化。3.Rac1/PAK1/p38MAPK信号通路检测:(1)Rac1 shRNA载体构建、转染及基因敲低效率的鉴定:①荧光显微镜观察阳性转染率;②western blot及real time PCR检测转染前后足细胞Rac1蛋白及mRNA表达水平;(2)抑制剂IPA-3及SB203580的配制:将粉末试剂溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配制成储存液,保存于-20℃C。用于处理细胞时,首先以DMSO进一步稀释,然后计算加入体积确保培养基内抑制剂终浓度为10μM;(3)GST Pull-down assay检测Rac1活性;(4)western blot检测不同处理组足细胞内PAK1及p38 MAPK磷酸化水平。4.检测调控Rac1信号通路对足细胞EMT及功能的影响:(1)检测调控Rac1信号通路后足细胞EMT指标及功能变化;(2)western blot、细胞免疫荧光等检测不同处理组转录因子β-catenin、Snail表达水平变化。(3)明确Rac1信号通路与β-catenin的相互作用:①构建激活型Rac1(CA-Rac1)、野生型Rac1(WT-Rac1)、失活型 Rac1(DN-Rac1)三种 Rac1 表达质粒;②构建 β-catenin表达质粒(Flag-β-catenin)以及空对照质粒;③共转染Rac1表达质粒与β-catenin表达质粒;④免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CO-IP)检测 Rac1/PAK1 与β-catenin的相互作用;⑤体外激酶实验(in vito kinase assay)检测p38 MAPK与β-catenin之间的相互作用。结果:1.高糖培养48小时后标志性蛋白p-cadherin和ZO-1表达明显减少(P<0.01)而间充质样蛋白FSP-1、α-SMA及desmin出现重新表达(P<0.01);Transwell小室白蛋白流入量显著增加(P<0.01),同时F-actin骨架蛋白出现明显的边集现象,伴随足细胞迁移率显著增高(P<0.01)。2.高糖刺激48小时导致了 Rac1蛋白的激活(P<0.01),以及PAK1、p38 MAPK磷酸化水平的增高(P<0.01);同时引起β-catenin的N端去磷酸化、Snail表达增加(P<0.05),以及β-catenin细胞核迁移。3.Rac1 shRNA显著抑制了足细胞EMT指标的发生(P<0.05),部分修正了足细胞功能损伤(P<0.05);同时明显减少了 PAK1、p38 MAPK磷酸化水平(P<0.05),降低了转录因子β-catenin、Snail活性(P<0.05),并部分阻断了β-catenin核迁移;抑制剂IPA-3及SB203580对Rac1活性均无显著影响(P>0.05),且SB203580对PAK1磷酸化无抑制作用(P>0.05)。4.Rac1对β-catenin的C端丝氨酸位点具有直接磷酸化修饰作用,这一作用导致β-catenin泛素化水平降低;同时,p38 MAPK通过磷酸化下游信号分子MEF2c 来结合 β-catenin。结论:1.高糖导致足细胞发生EMT及功能障碍。2.Rac1通过激活下游信号分子PAK1/p38 MAPK参与高糖诱导的足细胞EMT。3.高糖条件下Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路通过调节转录因子β-catenin活性与迁移,影响EMT相关基因及蛋白表达,从而导致足细胞发生EMT转化。4.调控Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路可阻断足细胞EMT的发生第二部分足细胞特异性Rac1RNAi转基因小鼠的建立与鉴定目的:构建与鉴定足细胞特异性Rac1 RNAi TG小鼠。方法:1.构建足细胞特异性Rac1 shRNA载体:(1)PCR扩增Nephrin启动子及mirRac1 序列;(2)利用酶切连接构建 pUp-Nephrin 和 pDown-SM30/mirRac1;(3)利用 gateway technology 构建 pLV.EX2d.null-Nephrin>SM30/mirRac1 表达质粒。2.获得足细胞特异的Rac1 RNAi TG小鼠:(1)建立F0小鼠:①利用酶切将载体进行DNA线性化并提纯;②通过DNA显微注射受精卵获取新生小鼠;③基因分型PCR鉴定阳性者为已整合外源基因的TG小鼠F0;(2)F0小鼠与C57BL/6野生型小鼠杂交与传代,鼠尾DNA提取及基因分型PCR筛选实验用TG小鼠。3.靶向敲低Rac1效率鉴定:(1)免疫荧光双标法检测Rac1、synaptopodin在野生型(wide type,WT)与TG小鼠肾脏组织中的表达;(2)western blot及real time PCR检测WT和TG小鼠原代足细胞中Rac1的表达。结果:1.获得鼠尾DNA PCR产物阳性的足细胞特异TG小鼠。2.Rac1蛋白在TG小鼠肾脏组织中表达明显少于WT小鼠,而synaptopodin的表达不受外源基因整合的影响。3.TG小鼠原代足细胞中Rac1蛋白和mRNA水平较WT小鼠显著降低(P<0.05)。结论:成功构建足细胞特异性Rac1 RNAi TG小鼠。第三部分靶向抑制Rac1信号通路对糖尿病肾病足细胞损伤的保护作用目的:1.构建野生型以及Rac1 RNAi转基因糖尿病小鼠模型。2.探讨足细胞靶向抑制Rac1对糖尿病肾病足细胞损伤的保护作用。3.探讨足细胞靶向抑制Rac1对糖尿病肾病蛋白尿及肾脏的保护作用。方法:1.建立WT和TG糖尿病小鼠模型:(1)以链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(WT-STZ/TG-STZ),或无菌柠檬酸缓冲液进行腹腔注射作为对照(WT-control/TG-control);(2)鼠尾静脉采血测定血糖≥16.7mmol即为造模成功。2.造模成功后4W-12W检测指标:体重、收缩压、血糖、24h尿蛋白定量等。3.糖尿病肾脏病变检测:(1)透射电镜测定足细胞数、足突融合率以及基底膜的平均厚度变异情况;(2)免疫荧光双标法或免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)测定足细胞裂孔膜(slit diaphragm,SD)蛋白p-cadherin和ZO-1,间充质样蛋白FSP-1、α-SMA、desmin及基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases,mmp9)的表达变化;(3)PAS染色观察肾组织病理改变;(4)IHC检测WT-1蛋白表达及足细胞凋亡情况。4.GST pull-down检测原代足细胞中Rac1蛋白活性;western blot检测PAK1及p38 MAPK磷酸化水平。结果:1.WT-STZ小鼠6W时电镜示足细胞出现足突轻度融合;免疫荧光双标显示SD蛋白p-cadherin和ZO-1表达开始降低,desmin表达增加;原代足细胞中Rac1蛋白活性显著提高,PAK1与p38MAPK磷酸化水平增加(P<0.01);8W时出现mmp9表达及蛋白尿(P<0.05);12W时足突明显融合,mmp9表达及蛋白尿水平明显加重(P<0.01),同时出现FSP-1重新表达。2.各观察时间段内WT-STZ组体重分别较WT-control组显著下降(P<0.01);4W-8W时TG-STZ组较WT-STZ组体重有所上升(P<0.05)。3.电镜显示各观察时间段内TG-STZ组均较WT-STZ组足突融合减轻;免疫荧光提示足细胞标志指标p-cadherin及ZO-1表达水平回升;desmin,mmp9与FSP-1明显减少。4.6W时TG-STZ较WT-STZ原代足细胞GTP-Rac1表达减少,同时PAK1与p38 MAPK磷酸化水平显著减少(P<0.05)。5.各观察时间段TG-STZ组均较WT-STZ组蛋白尿显著减少(P<0.05),同时PAS示肾小球基底膜(glomerular basement membrane,,GBM)与系膜区病变程度降低。6.各观察时间段TG-STZ与WT-STZ小鼠血糖血压无显著差别(P>0.05);四组组间足细胞数量无显著差异(P>0.05)。结论:1.糖尿病肾病蛋白尿的发生继发于足细胞损伤。2.足细胞靶向抑制Rac1通过灭活下游PAK1及p38 MAPK蛋白、恢复SD蛋白表达与功能,并逆转足细胞去分化而发挥足细胞保护作用。3.足细胞靶向抑制Rac1通过保护足细胞减少蛋白尿,通过减缓GBM和系膜区的病变进一步保护肾脏。