【目的】Pontin是一种拥有复杂细胞调控功能的ATP水解酶,参与调节基因转录、染色质重塑、DNA损伤应答、大分子复合物组装、细胞周期和细胞运动等,涉及的这些过程均有益于它的核心功能,即促进细胞增殖和生存等。Pontin已被证实在多种恶性肿瘤中过表达,是肿瘤细胞生长不可或缺的关键因子。胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)因其具备快速增殖、高度侵袭的特点而导致在手术中难以根治性切除,患者预后极差。目前有关Pontin与胶质瘤发生发展的关系尚不清楚,它是否可作为胶质瘤预后指标及治疗靶点的候选因子需进行系统性深入探索。本文研究的目的,首先是验证Pontin在胶质瘤中是否存在过表达,分析其与胶质瘤良恶性分级及患者预后的关系;其次探讨Pontin表达水平改变是否可影响胶质瘤细胞的增殖、侵袭表型;最后研究Pontin以何种分子机制影响细胞内基因转录及信号通路紊乱,在胶质瘤发生发展中发挥重要调控作用。【方法】1.应用GEPIA网络数据库,初步分析Pontin mRNA在不同恶性肿瘤中的表达情况,预测Pontin表达与胶质瘤患者生存期的关系;应用Western blot检测和比较永生化星形胶质细胞系UC2和7种GBM细胞系中Pontin的表达水平;利用cBioPortal数据库,筛选GBM中与Pontin基因存在共表达关系的前200个基因,将之提交到STRING绘制蛋白相互作用网络图,初步明确Pontin可能影响的生物学过程。2.应用组织芯片及免疫组织化学技术检测Pontin和Ki-67的表达水平,分析Pontin在不同级别胶质瘤中的表达变化,利用Pearson检验分析Pontin和Ki-67二者表达水平之间的相关性;结合临床随访数据,采用Kaplan-Meier法分析Pontin表达水平与患者生存期的关系;建立Cox比例风险回归模型,筛选胶质瘤患者预后的独立预测因子。3.利用慢病毒感染GBM细胞系(U87MG、U251)构建稳定敲低和过表达Pontin的亚细胞系和对照亚细胞系,运用EdU实验、流式细胞周期检测技术和平板克隆形成实验来对比各亚细胞系与对照细胞系之间的增殖活性与生存能力差异,运用transwell体外迁移、侵袭实验来检测各亚细胞系与对照细胞系间的迁移、侵袭能力的差异,以上可明确不同Pontin表达水平是否可对胶质瘤恶性生物学行为产生影响。4.利用上述构建的稳定敲低和过表达Pontin的U87MG亚细胞系建立裸鼠颅内原位移植瘤模型,运用活体成像技术观察并拍摄移植瘤生长状态,取出鼠脑后经HE染色观察移植瘤大小,利用免疫组织化学实验检测Pontin与Ki-67的表达情况。5.将稳定敲低Pontin的U87MG亚细胞系及对照亚细胞系样品送至转录组测序,通过分析测序结果,提示Pontin可能调控TGFβ/SMAD通路及TGFβR2基因表达,利用Western blot及qRT-PCR验证该通路下游基因的表达是否受Pontin的影响,利用该通路的激活剂及抑制剂进一步明确Pontin对该通路活化状态及细胞恶性表型的影响。6.查阅文献及数据库,构建包含TGFβR2启动子的荧光素酶报告基因,测定Pontin敲低和过表达对该报告基因荧光素酶活性的影响,联合运用免疫共沉淀实验与免疫荧光实验,探索LEF1能否与Pontin相互作用结合于TGFβR2启动子,协同调控TGFβR2基因转录。7.在稳定敲低Pontin的GBM亚细胞系中回补TGFβR2,利用EdU、克隆形成、Transwell体外迁移实验,验证恢复TGFβR2表达对已敲低Pontin的GBM亚细胞系中TGFβ/SMAD通路抑制及增殖、生存、迁移能力下降的挽救效果。【结果】1.GEPIA数据库预测结果显示Pontin在多种不同类型肿瘤中的表达量均高于相应瘤周正常组织,包括GBM和低级别胶质瘤(low grade glioma,LGG),且预测结果显示Pontin高表达的胶质瘤患者无病生存期(DFS)和总生存期(OS)较低表达者明显降低。Western blot检测结果显示,GBM各细胞系中Pontin表达水平均显著高于永生化星形胶质细胞系UC2。由cBioPortal筛选出的GBM中Pontin共表达基因,它们在功能上富集于DNA复制、细胞周期、RNA剪接等过程,预示GBM细胞中Pontin可影响以上生物学过程。2.组织芯片及免疫组化结果显示胶质瘤组织中的Pontin表达水平明显高于对照组,Pontin阳性标记指数(LI%)随胶质瘤级别的升高而升高,各胶质瘤组与对照组之间以及各级别胶质瘤组间的差异均有统计学意义(P<0.001)。相关分析显示Pontin LI%与Ki-67 LI%呈显著正相关性。Kaplan-Meier生存分析显示,将患者按照年龄、IDH基因状态或KPS评分分为数个亚群,以上亚群中Pontin高表达患者的OS与DFS均较低表达组低,以上差异均具有统计学意义(P<0.01~0.0001)。Cox回归分析显示,Pontin LI%与IDH基因状态同为胶质瘤患者的独立预后因子。3.Western blot证实敲低与过表达Pontin的稳定亚细胞系构建成功。EdU结果证实敲低和过表达Pontin可分别降低和增加GBM细胞的增殖活性;流式细胞周期检测发现敲低Pontin可诱导GBM细胞的G1期阻滞;克隆形成实验结果说明敲低和过表达Pontin可分别降低和增加GBM细胞生存能力;Transwell体外迁移、侵袭实验结果证实敲低和过表达Pontin可分别降低和增加GBM细胞迁移和侵袭活性。4.裸鼠原位瘤移植实验显示,敲低Pontin的亚细胞系组与相应对照组裸鼠相比,肿瘤的生长速度减慢、大小均明显缩小,而过表达Pontin的亚细胞系组则与敲低组表现相反。将鼠脑石蜡包埋与切片后进行HE染色及免疫组化试验,结果显示敲低Pontin组中移植瘤的大小较对照组缩小,且Pontin和Ki-67的表达也均较对照组降低,而过表达Pontin组则表现相反。5.经转录组测序分析发现,敲低Pontin后的差异基因功能上富集于染色质重塑、细胞周期、TGF-β信号通路等。进一步实验验证发现,敲低Pontin可显著抑制TGFβ/SMAD通路下游基因及TGFβR2基因表达,Western blot验证发现敲低和过表达Pontin时该通路中TGFβR2、p-SMAD2/3、CTGF的表达均相应下降或增高。TGFβ1与LY2109761分别是TGFβ/SMAD通路的激动剂与抑制剂,在Pontin敲低组中TGFβ1的刺激未能使此通路下游基因表达上调,而LY2109761能抑制各组的下游基因表达。激动剂与抑制剂对胶质瘤细胞的增殖与迁移的影响也与TGFβ/SMAD通路下游基因表达变化相一致。6.通过联合筛查Pontin结合蛋白及TGFβR2启动子中可能存在的转录因子结合位点,预示LEF1促进TGFβR2基因转录需要Pontin的协同作用。TGFβR2荧光素酶报告基因实验结果显示,单转Pontin过表达质粒,可增加TGFβR2转录活性,且共转Pontin及LEF1可有效放大该转录激活作用,而敲低Pontin表达可降低TGFβR2转录水平。7.免疫共沉淀结果显示LEF1出现在Pontin的免疫沉淀复合物中,提示Pontin与LEF1存在相互结合。免疫荧光共定位结果提示内源性Pontin与LEF1共定位于细胞核内。8.在敲低Pontin的亚细胞系中回补TGFβR2,Western blot结果证实TGFβ/SMAD通路中的下游蛋白p-SMAD2/3、CTGF表达被恢复至未敲低Pontin之前的水平,EdU、克隆形成实验和Transwell体外迁移实验结果提示,回补TGFβR2可以有效挽救Pontin敲低对GBM细胞增殖、生存与迁移能力的负调控作用。【结论】1.Pontin在胶质瘤中均存在过表达,且其表达水平随胶质瘤良恶性级别的升高而升高,与Ki-67成正相关,故其阳性标记指数可作为评价胶质瘤良恶性级别的辅助指标。Pontin的表达水平与患者生存时间密切相关,可作为胶质瘤患者预后的独立预测因子。2.Pontin调控TGFβ/SMAD通路的可能机制是,Pontin通过与转录因子LEF1相互作用并结合于TGFβR2基因的启动子区域,作为转录共激活因子促进TGFβR2基因转录,进而引起此通路的活化。3.TGFβR2是Pontin调节胶质瘤增殖、生存与迁移侵袭的重要靶点,Pontin可活化TGFβ/SMAD通路,上调关键效应蛋白CTGF的表达水平,从而使胶质瘤细胞获得更高的增殖、生存、迁移、侵袭能力。4.Pontin在胶质瘤中表达异常升高是导致其发生发展的重要原因,也是胶质瘤细胞拥有活跃增殖活性和迁移侵袭能力的重要分子机制。通过靶向沉默Pontin表达可抑制胶质瘤细胞的增殖、生存与迁移侵袭从而发挥胶质瘤抑瘤作用,这极有可能成为对恶性胶质瘤进行有效干预的重要策略。