【摘 要】
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目的:建立放射性颌骨骨坏死（ORNJ）大鼠模型与放射损伤骨髓间充质干细胞（BMSCs）细胞模型,探究骨形态发生蛋白-2（BMP-2）对ORNJ组织纤维化的抑制作用,以及BMP-2对放射性损伤后BMSCs向成纤维方向分化的抑制作用,并探讨其可能的分子机制。方法:1.分离鉴定骨髓间充质干细胞,建立BMSCs细胞放射损伤模型,并用免疫荧光在不同时间点检测未放射组、放射组向肌成纤维细胞（MFB）的分化情况
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目的:建立放射性颌骨骨坏死（ORNJ）大鼠模型与放射损伤骨髓间充质干细胞（BMSCs）细胞模型,探究骨形态发生蛋白-2（BMP-2）对ORNJ组织纤维化的抑制作用,以及BMP-2对放射性损伤后BMSCs向成纤维方向分化的抑制作用,并探讨其可能的分子机制。方法:1.分离鉴定骨髓间充质干细胞,建立BMSCs细胞放射损伤模型,并用免疫荧光在不同时间点检测未放射组、放射组向肌成纤维细胞（MFB）的分化情况。2.在不同时间点、使用不同剂量BMP-2对BMSCs细胞放射损伤模型进行干预,使用Western blot检测其向MFB的分化程度,选择最佳干预剂量。3.体外培养BMSCs,随机分为对照组、放射组（仅使用放射线放射）、BMP-2组（放射后加入BMP-2干预）、BMP-2+头蛋白（Noggin）,通过免疫荧光、western blot及RT-PCR检测不同组别α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）等纤维化相关蛋白及mRNA分子的表达,并进一步检测BMP-2干预后转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad2/3、p-Smad2/3等蛋白及mRNA分子的表达变化情况。4.建立ORNJ大鼠模型并通过Micro CT及组织切片等方法检测未放射组、放射组、仅拔牙组骨密度与纤维化程度。5.在ORNJ大鼠模型拔牙后以胶原海绵为载体搭载30μg/mL的BMP-2填塞拔牙窝,3个月后通过Micro CT及组织切片检测骨密度与纤维化程度,观察BMP-2对ORNJ的治疗效果。结果:1.成功分离SD大鼠BMSCs,并通过分化能力、表面标记物、细胞形态等方面鉴定细胞种类与纯度。在放射损伤模型实验中,免疫荧光结果显示在任何时间点放射组BMSCs中α-SMA表达量均显著高于未放射组,证明放射组BMSCs向MFB分化增强,纤维化分化程度增强,提示BMSCs可能是ORNJ纤维化过程中的关键细胞。2.BMP-2浓度梯度结果表明,使用100ng/mL BMP-2作用于放射损伤BMSCs 7d时,MFB分化程度相较于其他组别更轻。3.BMSCs放射损伤模型（放射组）中α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等纤维化相关蛋白及分子的表达较对照组明显增高,使用BMP-2干预后其表达量较放射组明显下降,且差异具有统计学意义,BMP-2+Noggin组表达量与放射组无统计学差异。同时,放射组BMSCs中TGF-β1及其下游的p-Smad2/3分子表达量明显增高,使用BMP-2干预后,其表达量显著下降,而Noggin可明显抑制BMP-2作用后TGF-β1及其下游分子的下降。4.通过每次放射剂量为7Gy,放射5次,隔一天放射一次的建模方法成功建立ORNJ大鼠损伤模型,大体观察符合ORNJ临床特征。进一步使用Micro CT及组织切片进行检测,发现放射拔牙组骨密度显著降低、骨小梁更脆弱、组织纤维化显著增高。5.大鼠ORNJ模型拔牙时使用30μg/mL的BMP-2胶原填塞,可以促进骨密度增加、降低组织纤维化程度。结论:大鼠ORNJ模型中组织纤维化程度显著增高,放射损伤后BMSCs向纤维化方向分化增加,提示BMSCs可能是ORNJ组织纤维化的细胞来源之一。BMP-2可抑制放射损伤的BMSCs向纤维化方向分化,并可能与抑制TGFβ1/Smad通路中Smad2/3磷酸化有关。BMP-2作用于ORNJ动物模型,放射损伤部位骨密度明显增加、胶原沉积降低、纤维化程度降低,表明BMP-2对ORNJ具有良好的治疗效果。
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