论文部分内容阅读
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是全世界严重的公共卫生问题之一,根据世界卫生组织报道,全球约有2.4亿人是慢性HBV表面抗原(HBV surface antigen,HBsAg)携带者,慢性乙型肝炎患者的HBsAg阳性地方性水平在低(2%)和高(8%)之间存在较大的区域差异[1,2]。有研究报道慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者每年约有2%~6%发展为肝硬化以及肝癌[3],每年大约有65万人死于慢性乙型肝炎所诱发的肝硬化失代偿和肝癌等疾病[4]。慢性HBV感染也是我国最主要的慢性病毒感染,我国大约有9300万慢性乙型肝炎病毒肝炎携带者,大部分患者来自母婴传播或者来自幼年时期的感染,慢性乙型肝炎病毒感染是影响我国健康的重大疾病。长期慢性肝脏炎症容易导致肝硬化、肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。乙型肝炎的短期爆发性炎症会导致HBV感染相关的慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF),在中国和亚太地区ACLF通常被定义为慢性肝病基础上的急性肝损伤[5]。ACLF早期伴随着机体系统性炎症因子风暴,病情发展很快,短期内死亡率很高(28天死亡率>30%)[6]。HBV病毒是一类嗜肝性病毒,但其本身不会直接引起肝细胞损伤,是一类非细胞致病性病毒。当前认为,机体对HBV的免疫应答是导致肝损伤的主要因素[7]。一些研究显示,HBV特异性CD8~+T细胞在HBV病毒清除和肝细胞损伤中起主导作用:其一方面可以分泌IFN-γ和TNF-α等细胞因子通过非溶胞途径介导肝内HBV病毒的清除,另一方面可以通过穿孔素-颗粒酶、Fas-FasL途径直接介导感染HBV肝细胞的杀伤和病毒的清除[8]。CD4~+T细胞作为重要的辅助性T细胞,其在慢性乙型肝炎肝脏损伤中的作用尚不清楚。一项关于急性自限性乙型肝炎的临床研究,发现了比较强的HBV特异性CD4~+T细胞应答[9],这提示HBV特异性CD4~+T细胞很可能参与了自限性乙型肝炎中的HBV病毒清除。我们课题组前期开展了关于HBV相关ACLF的全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS),从全基因组角度分析了宿主遗传变异对乙型肝炎相关的ACLF的影响。结果显示HLA-DR区域的rs3129859位点是HBV显著的关联位点,特别是HLA-DRB1*12:02等位是最显著的HBV相关ACLF易感风险等位,而HLA-DARB1*0803等位是HBV相关ACLF保护性等位[10]。上述结果提示,HBV特异性CD4~+T细胞可能参与了HBV感染患者肝损伤过程。本研究重在研究慢性HBV感染患者的HBV特异性CD4~+T细胞在肝损中的作用。本研究采集慢性HBV感染患者的外周血样本,分离提纯PBMCs细胞,并用HBsAg和HBcAg蛋白来源的多肽刺激PBMCs细胞,分析HBV特异性CD4~+T细胞的胞内因子:IFN-γ及TNF-α。在本研究中,我们总共分析了33名无炎症/无炎症/低炎症慢性HBV感染患者的HBV特异性CD4~+T细胞应答,其谷丙转氨酶ALT小于2倍正常水平上限(upper limit of normal,ULN);和15名重度乙型肝炎(hepatitis B flare)患者(ALT>5×ULN)的HBV特异性CD4~+T细胞。并且我们利用了HLA-DRB1*1202或HLA-DARB1*0803基因型的患者样本鉴定了CD4~+T细胞表位。我们的研究结果如下:1.2016年1月至2019年2月西南医院感染科门诊诊断为慢性HBV感染的无炎症/低炎症患者纳入199例。从这199例患者中,我们根据样本PBMCs大于6×10~6,筛选出33例样本进行HBV特异性CD4~+T细胞应答分析,这33例样本中包括19例HBeAg阳性患者,7例HBeAg血清学转换患者和7名HBsAg血清学转换患者。另外我们收集了15例高炎症慢性HBV感染患者样本,这些样本包括了11例HBeAg阳性患者和4例HBeAg阴性患者,这些高炎症慢性HBV感染患者中的06号、09号、10号、11号和15号患者采集多时相点样本。2.在33例无炎症/低炎症HBV感染患者患者(ALT<2×ULN)中,与HBV特异性CD4~+T细胞分泌IFN-γ功能相比,HBV特异性CD4~+T细胞分泌TNF-α功能相对完善。有52%(17/33)患者检测到了HBV Core特异性TNF-α~+CD4~+T细胞,只有15%(5/33)的患者检测到了HBV Core特异性IFN-γ~+CD4~+T细胞。HBV Core特异性TNF-α~+CD4~+T频率细胞的均值及标准差为0.202%和0.451%(n=33),HBV Core特异性IFN-γ~+CD4~+T细胞频率的均值及标准差为0.032%和0.106%(n=33),两者差异统计学显著(P=0.013)。有52%(17/33)患者检测到了HBV S特异性TNF-α~+CD4~+T细胞,只有39%(13/33)的患者检测到了HBV S特异性IFN-γ~+CD4~+T细胞。HBV S特异性TNF-α~+CD4~+T频率细胞的均值及标准差为0.171%和0.368%(n=33),HBV S特异性IFN-γ~+CD4~+T细胞频率的均值及标准差为0.038%和0.09%(n=33),两者差异统计学显著(P=0.037)。3.在无炎症/低炎症慢性HBV感染患者中,HBV特异性IFN-γ~+CD4~+T细胞的占比与HBV病毒清除相关。在19名可检测到HBV Core特异性CD4~+T细胞(分泌TNF-α应答或分泌IFN-γ应答)患者中,HBeAg阳性患者、HBeAg阴性患者和HBsAg血清学转换患者的HBV Core特异性IFN-γ~+CD4~+T细胞占比的均值(标准差)分别为1.6%(5.4%),4.5%(5.2%)和66.7%(57.7%)。HBV Core特异性IFN-γ~+CD4~+T细胞的占比与患者的血清HBsAg水平负相关(Rs=-0.442,P=0.058)。在23名可检测到HBV S特异CD4~+T细胞(分泌TNF-α应答或分泌IFN-γ应答)患者中,HBeAg阳性患者、HBeAg阴性患者和HBsAg血清学转换患者的HBV S特异性IFN-γ~+CD4~+T细胞的平均值(标准差)分别为11.4%(26.8%),54.8%(52.8%)和70.1%(42.8%)。HBV S特异性IFN-γ~+CD4~+T细胞的占比与患者的血清HBsAg水平显著负相关(Rs=-0.563,P=0.005)。4.在15例高炎症慢性HBV感染患者(ALT>5×ULN,n=15)中,HBV特异性TNF-α~+CD4~+T细胞与肝损的程度相关。HBV Core特异性TNF-α~+CD4~+T频率细胞的均值及标准差为2.496%和6.979%,HBV Core特异性IFN-γ~+CD4~+T频率细胞的均值及标准差为0.564%和1.390%,HBV S特异性TNF-α~+CD4~+T频率细胞的均值及标准差为0.793%和1.156%,HBV S特异性IFN-γ~+CD4~+T频率细胞的均值及标准差为0.158%和0.288%。高炎症慢性HBV感染患者(n=15)TNF-α~+CD4~+T细胞的频率高于无炎症/低炎症HBV感染患者(n=33,ALT<2×ULN),两者差异统计学显著(P<0.001)。在高炎症慢性HBV感染患者(ALT>5×ULN)中,HBV特异性TNF-α~+CD4~+T细胞的频率与患者血清ALT水平显著正相关:HBV Core特异性CD4~+T细胞频率与高炎症慢性HBV感染患者血清ALT水平正相关(Rs=0.661,P=0.007);HBV S特异性CD4~+T细胞频率与高炎症慢性HBV感染患者血清ALT水平正相关(Rs=0.661,P=0.007)。HBV特异性IFN-γ~+CD4~+T细胞的频率与患者血清ALT水平不相关(P>0.05)。5.我们根据肽矩阵的结果,基于肽段刺激或者HLA-DRB1同型BLCLs负载肽刺激体系,至少在两个患者中验证候选肽的HLA-DRB1的限制性。鉴定出了HLA-DRB1*0803限制性CD4~+T细胞表位:core46-60,core56-70,core66-80,core136-150,core161-175,B&C_S81-95,B&C_S156-170,B&C_S186-200;鉴定出了HLA-DRB1*1202限制性CD4~+T细胞表位:core116-130,core166-180,B&C_S6-20,B&C_S36-50,B&C_S51-65,B&C_S56-70,B&C_S76-90,B&C_S141-155,C_S191-205。