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研究目的利用小鼠结肠癌腹腔转移模型,应用白细胞介素-15(Interleukin-15,IL-15)表达质粒pHi2-spIL15-CMV-TAT(L3)对小鼠结肠癌腹腔转移进行基因治疗,观察其在控制肿瘤生长、延长患癌动物生存期、延缓肿瘤转移的作用,分析腹腔免疫细胞变化,探讨IL-15抑制转移瘤生长的可能机制,为IL-15为基础的肿瘤免疫基因治疗提供实验基础。研究方法本实验首先通过腹腔注射小鼠结肠癌细胞CT26,建立小鼠结肠癌腹腔转移癌的模型,然后将表达绿色荧光蛋白载体pHi2-EGFP-CMV-TAT (L6)注射于已建模小鼠腹腔,进行体内转染。采用小动物活体成像技术,观察绿色荧光蛋白表达,评估转染情况与目的基因的表达效率。进一步利用小鼠结肠癌腹腔转移癌模型,腹腔注射表达IL-15的质粒PHi2-spIL15-CMV-TAT (L3)为治疗组；腹腔注射空载质粒pHi2-CMV-TAT-MCS(M7)、腹腔注射PBS、腹腔不注射治疗作为对照组；无肿瘤组作为空白组。评估不同治疗方式下对荷瘤小鼠肿瘤大小、体重、腹水形成、生存期的影响。通过流式细胞术,分析不同治疗组荷瘤小鼠腹水中CD4、CD8、CD25,NKG2D、CDllb的表达。研究结果1.荷瘤小鼠腹腔注射能表达绿色荧光蛋白质粒L6,活体成像显示小鼠腹腔有绿色荧光蛋白表达。2.翀瘤对照组(M7组、PBS组、肿瘤未治疗组)7周内荷瘤小鼠大部分死亡,期间体重增加迅速,剖检均可见腹水和腹腔内广泛肿瘤种植；治疗组(L3组)中多数小鼠生存时间延长,体重增加缓慢。3.治疗组(L3组)荷瘤小鼠的生存期延长,与其它各组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。4.治疗组(L3组)CD4+T细胞绝对值分别在第1周和第2周与对照组(M7组、PBS组、肿瘤未治疗组)、空白组(无肿瘤组)差异均有统计学差异(P<0.05),治疗组的值高于对照组与空白组。治疗组(L3组)CD8+T细胞绝对值在第1周与对照组(M7组、PBS组、肿瘤未治疗组)、空白组(无肿瘤组)差异均有统计学差异(P<0.05),治疗组的值高于对照组、空白组。在第2周时,治疗组(L3组)CD8+T细胞绝对值与对照组(M7组、PBS组、肿瘤未治疗组)、空白组(无肿瘤组)差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗组(L3组)CD8+/CD4+细胞比值分别在第1周和第2周与对照组(M7组、PBS组、肿瘤未治疗组)、空白组(无肿瘤组)差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗组(L3组)CD4+CD25+T细胞绝对值在第1周与对照组(M7组、PBS组、肿瘤未治疗组)、空白组(无肿瘤组)差异均有统计学意义(P<0.05),治疗组的值低于对照组。第2周治疗组(L3组)CD25+CD4+T细胞绝对值与对照组(M7组、PBS组、肿瘤未治疗组)、空白组(无肿瘤组)差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗组(L3组)CDllb+巨噬细胞绝对值分别在第1周与第2周与对照组(M7组、PBS组、肿瘤未治疗组)、空白组(无肿瘤组)差异均有统计学差异(P<0.05),治疗组的值高于对照组与空白组。治疗组(L3组)NKG2D+NK细胞绝对值、淋巴细胞比例分别在第1周和第2周与对照组(M7组、PBS组、肿瘤未治疗组)、空白组(无肿瘤组)差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗组(L3组)腹腔细胞总数分别在第1周与第2周与对照组(M7组、PBS组、肿瘤未治疗组)、空白组(无肿瘤组)差异均有统计学意义(P<0.05),治疗组的值高于对照组。5.治疗组(L3组)在第1周,CD8+T细胞绝对值、CD25+CD4+T细胞绝对值、CDllb+巨噬细胞绝对值、淋巴细胞比例、细胞总数与第2周比较,差异有统计学意义(P<0.05)；淋巴细胞比例、CD4+CD25+T细胞绝对值第1周少于第2周,而CD8+T细胞绝对值、CDllb+巨噬细胞绝对值、细胞总数第1周多于第2周。另外CD4+T细胞绝对值、CD8+/CD4+细胞比值、NKG2D+NK细胞绝对值则第1周与第2周差异无统计学意义(P>0.05)。研究结论1.腹腔注射质粒载体可以在体内实现基因转染,表达目的基因。2.pHi2-spIL15-CMV-TAT (L3)腹腔基因治疗小鼠腹腔转移肿瘤,可以显著延缓肿瘤的生长速度,延长荷瘤小鼠生存期。3.pHi2-spIL15-CMV-TAT (L3)腹腔基因治疗可增强荷瘤小鼠的杀伤肿瘤细胞的能力,其机制是通过提高CD4+辅助性T细胞,CD8+细胞毒性T细胞腹腔浸润,抑制CD4+CD25+T细胞增殖,增加腹腔CD11b+巨噬细胞表达,提示IL-15通过提高机体的自身免疫系统,增加机体的获得性免疫系统的抗肿瘤反应,抑制肿瘤生长。4.pHi2-spIL15-CMV-TAT(L3)腹腔基因治疗未增加NKG2D+NK细胞的表达,提示本模型系统中,IL-15未通过增加NKG2D+NK细胞的浸润发挥抗肿瘤作用。本实验为探讨IL-15肿瘤免疫基因治疗机制提供了一定的实验依据,为进一步的实验研究打下了坚实的基础。