药用植物的生长环境对中药的品质具有决定性的作用，但以往人们关注更多的是环境中光照、温度、湿度等非生物因素，而忽视了微生物等生物因素的影响。越来越多的研究表明，微生物等生物因素对中药的品质也有着非常重要的作用。内生真菌（endophytic Fungi）就是一种被认为对药用植物生长及其次生代谢具有显著影响的生物因素。目前内生真菌对药用植物影响及其作用机制的研究还不够深入，在一定程度上制约了对内生真菌影响中药品质的认识和内生真菌在药用植物栽培中的应用。本课题以我国重要药用植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的内生真菌作为研究对象，筛选得到能够产生与丹参相同活性成分的目标菌株；然后以丹参毛状根为研究平台，研究目标菌株对丹参毛状根生长及其有效成分生物合成的影响；通过现代化学分离手段研究目标菌株促进丹参毛状根有效成分生物合成的物质基础，初步明确其活性成分（群）；通过代谢组学的技术手段研究活性成分（群）对丹参毛状根整体代谢轮廓的影响，探讨代谢产物的积累规律；通过转录组学的技术手段研究活性成分（群）对丹参毛状根转录水平的影响，分析基因表达谱的变化；通过蛋白组学的技术手段研究活性成分（群）对丹参毛状根蛋白水平的影响，寻找差异表达蛋白。期望通过整合代谢组学、转录组学和蛋白组学等功能基因组学的技术手段阐明丹参内生真菌影响丹参毛状根的分子机制，为揭示内生真菌影响中药材品质及其机制提供实验基础和科学依据。主要研究结果如下：1.筛选出一株能够产生丹参酮类物质的目标菌株。采用传统分离方法从陕西商洛野生和栽培丹参、安徽亳州栽培丹参中分离得到内生真菌103株，根据形态合并为56个形态型；将其小量发酵后提取次生代谢产物，采用HPLC、 LC-MSn和UHPLC-HRMS等分析手段从中筛选到了一株能够产生丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的内生真菌D16，通过ITS和5.8S基因序列鉴定为木霉属的深绿木霉Trichoderma atroviride，为下一步研究丹参内生真菌对丹参毛状根的影响提供了目标菌株，同时也为通过微生物发酵获得丹参酮类活性成分提够了候选菌株。2.发现目标菌株D16菌丝对丹参毛状根中丹参酮的含量具有促进作用。将丹参内生真菌D16菌丝通过打孔的方式加入到丹参毛状根培养液中，考察D16菌丝对丹参毛状根生长和次生代谢成分生物合成的影响，结果表明在D16菌丝与丹参毛状根共培养的5天内， D16菌丝对丹参毛状根的生物量无显著影响；对丹参毛状根中丹酚酸类成分的含量前期无显著影响，到后期有显著的抑制作用；但对丹参毛状根及其培养液中的丹参酮类成分的含量具有不同程度的促进作用。3.明确D16诱导子对丹参毛状根生长和丹参酮的合成具有极显著的促进作用。为了去除D16菌丝的毒力作用以便在更长时间内考察D16对丹参毛状根的影响，我们将D16菌丝的水溶性提取物作为诱导子研究其在18天内对丹参毛状根生长和次生代谢成分生物合成的影响，结果表明：a. D16诱导子对丹参毛状根的生物量有一定的促进作用；b.对丹酚酸类成分的生物合成有一定抑制作用；c.对丹参酮类成分的生物合成有极其显著的促进作用。该研究明确了D16对丹参毛状根的生长和有效成分的积累具有重要影响。4.发现D16促进丹参酮合成的活性因子是蛋白-多糖部位（Protein-polysaccharidesfraction，PSF），且D16的作用具有一定的特异性。通过活性跟踪及现代化学分离手段对D16促进丹参酮生物合成的物质基础进行研究，发现PSF是其促进丹参酮生物合成的主要活性成分群；进一步选取另外5株丹参内生真菌对D16菌丝PSF促进丹参酮生物合成的特异性进行研究，结果表明6株丹参内生真菌菌丝PSF对丹参酮生物合成均有不同程度的促进作用，但D16菌丝PSF的作用强度明显大于其余5株内生真菌，说明D16菌丝PSF促进丹参酮生物合成具有一定的特异性。5.运用代谢组学手段揭示PSF处理后丹参毛状根整体代谢轮廓的变化规律。通过UHPLC-HRMS的代谢组学技术对不同时间点PSF作用下丹参毛状根整体代谢轮廓的变化进行了研究，主成分分析和聚类分析结果显示在PSF作用下丹参毛状根整体代谢轮廓发生了显著的变化，通过高分辨分子离子峰、二级碎片离子峰、网络数据库、文献资料以及标准品的比对鉴定到差异代谢物33个，其中丹参酮类成分10个、丹酚酸类成分6个、氨基酸4个、有机酸6个、其他成分7个；定量比较分析发现PSF主要促进了丹参酮类成分的生物合成，对酚酸类成分有轻微抑制作用。6.运用转录组学手段对PSF处理后丹参毛状根在转录水平的变化规律进行了分析，并通过RT-PCR进行了验证。通过转录组的高通量测序和生物信息学分析手段，建立了丹参毛状根功能基因数据库，包含121353个unigene，平均长度为825bp，其中注释到公共数据库的unigene数为48588个，基本覆盖了植物主要的生命活动过程；对D16菌丝PSF作用下3、6、12天转录组的整体变化进行了差异分析，筛选得到2307个差异表达unigene。对这些差异表达的unigene进行深度分析发现，D16菌丝PSF首先使丹参毛状根产生了强烈的防卫反应，同时通过钙离子、氧化应激、乙烯、茉莉酸和水杨酸等信号转导过程促进转录因子等基因的表达水平发生变化，进而导致氧化还原、萜类和酚酸类等次生代谢过程的基因发生差异表达，最后使得丹参毛状根的整体代谢轮廓发生变化。运用Real-time PCR技术验证了PSF处理后丹参酮生物合成途径中的5个关键酶基因HMGR、DXR、GGPPS、CPS和KSL的表达情况，其结果与转录组数据基本一致。7.通过iTRAQ蛋白组学的技术手段研究D16菌丝PSF作用下丹参毛状根蛋白水平的变化，依据模式植物拟南芥蛋白数据库鉴定得到1476个蛋白，对蛋白表达量进行分析筛选得到差异表达蛋白89个；深度分析发现D16菌丝PSF主要是通过亮氨酸重复元件、Ca2+、过氧化物、蛋白磷酸化和茉莉酸合成等信号转导途径调节丹参毛状根糖类和氨基酸的合成与代谢以及基因的转录和蛋白质的翻译过程，进而导致次生代谢相关酶蛋白表达量的变化，最终影响丹参毛状根的整体代谢轮廓发生变化。