论文部分内容阅读
目的:本研究拟通过建立新西兰大白兔OSAHS模型及其下颌前移矫治器（mandibular advancement device,MAD）的治疗,研究OSAHS以及MAD治疗对颏舌肌组织（genioglossus,GG）中NF-κB P65及炎症细胞因子TNF-α和IL-6的影响。探讨OSAHS对GG损害的可能炎性机制,为OSAHS导致GG损害的发病机理研究以及MAD治疗OSAHS对GG影响的研究提供一定的理论基础。方法:1动物分组:纯种雄性新西兰大白兔18只,6月龄,体重3.0kg3.5kg。随机分为3组,每组6只,分别是1)阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征组（Group OSAHS）2)下颌前移矫治器组（Group MAD）和3)正常对照组（control group）。2动物模型的建立:造模前将三组实验动物置于仰卧位,进行上气道螺旋CT扫描（美国Lightspeed GE16层型螺旋CT机）和多导睡眠监测（美国邦德Monet型多导睡眠监测系统）,以排除先天性OSAHS或解剖性上气道狭窄。1%戊巴比妥钠对OSAHS组和MAD组动物行全身麻醉后,在距软硬腭交界1.5cm处的软腭黏膜下肌层注射聚丙烯酰胺水凝胶混合物2ml。注射完成后,应用以上同样方法拍摄上气道螺旋CT并进行多导睡眠监测,以确定OSAHS动物模型建立成功。OSAHS动物模型建立成功后,MAD组的OSAHS兔适应3天后佩戴下颌前移矫治器（MAD）。MAD由自凝牙托粉和牙托水制作而成,用玻璃离子粘结剂粘固于上前牙。当MAD戴入兔口内后,其前斜面与上颌平面成60°角,导下颌前移3mm4mm,咬合打开2mm3mm。建模完成后,应用以上同样方法拍摄上气道螺旋CT并进行多导睡眠监测,以评估MAD的疗效。3仰卧位睡眠建模完成后第4天,检查实验动物注射伤口,无破溃、无感染,进食、进水无异常。接下来的8周,每日上午按5ml/kg6ml/kg的剂量对三组实验动物经口腔灌注10%水合氯醛,使其仰卧位睡眠2小时4小时。其余时间正常进食﹑进水﹑自由活动。4标本的采集及处理8周后,术前24小时禁食禁水,经耳缘静脉以2ml/kg的剂量注射1%戊巴比妥钠,对动物行全身麻醉。将兔置于仰卧位并固定四肢,打开口腔后将舌抬起,逐层分离舌下筋膜、肌肉暴露颏舌肌,将颏舌肌的两端固定后小心离断,用预冷的生理盐水冲洗表面血液,将每只兔的颏舌肌组织剪成大小、体积相似的两块,液氮速冻,-80℃冻存。5颏舌肌（GG）细胞核中NF-κB P65蛋白的表达量测定按照核蛋白提取试剂盒说明书抽提三组动物GG中的核蛋白,然后用BCA法测定核蛋白的蛋白浓度,确定蛋白上样量。蛋白质免疫印迹分析法（Western Blot）测定NF-κB P65蛋白相对于细胞核内参蛋白—组蛋白3（Histone 3,H3）的表达量。6颏舌肌（GG）中炎症细胞因子TNF-α和IL-6的浓度测定按照兔肿瘤坏死因子α（TNF-α）和兔白细胞介素6（IL-6）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书测定三组动物GG中的TNF-α和IL-6在波长为450nm下的吸光度值,按照标准曲线计算出炎症细胞因子TNF-α和IL-6的浓度。7相关性分析将三组动物GG中NF-κB P65蛋白相对表达量与TNF-α和IL-6的浓度以及AHI、Sa O2进行相关性分析。结果:1动物的一般情况:建模3天后,各组动物均能正常饮水、进食、自由活动。三组动物在建模前、建模2周以及建模8周后的体重无明显差异。它们在仰卧位睡眠时,OSAHS组鼾声明显且不均匀,睡眠过程中易惊醒;MAD组部分呼吸音较重或轻微打鼾,基本平稳;正常对照组呼吸均匀,状态平稳。2上气道螺旋CT结果:OSAHS组与MAD组、对照组比较,软腭1/4点﹑1/2点和3/4点处上气道矢状向间隙及上气道横截面积均明显减小,差异有显著性（P<0.05）;而MAD组较对照组上述指标虽然减小,但差异无显著性（P>0.05）。3多导睡眠监测记录:OSAHS组动物与MAD组、对照组相比,呼吸暂停低通气指数升高、血氧饱和度下降、睡眠效率减低,差异有显著性（P<0.05）;MAD组较对照组以上指标的变化无显著性差异（P>0.05）。4颏舌肌（GG）细胞核中NF-κB P65蛋白相对表达量:OSAHS组、MAD组和正常对照组的NF-κB P65蛋白相对表达量分别为0.44±0.08、0.30±0.09、0.24±0.07。OSAHS组较MAD组、对照组明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;MAD组与对照组相比升高,但无统计学意义（P>0.05）。5颏舌肌（GG）中TNF-α和IL-6的浓度:OSAHS组、MAD组和正常对照组的TNF-α浓度分别为96.80±18.00pg/ml、71.16±20.18pg/ml、64.80±19.51pg/ml。OSAHS组较MAD组、对照组明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;MAD组与对照组相比升高,但无统计学意义（P>0.05）。OSAHS组、MAD组和正常对照组的IL-6浓度分别为93.30±16.97pg/ml、69.25±14.28pg/ml、63.49±13.15pg/ml。OSAHS组较MAD组、对照组明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;MAD组与对照组相比升高,但无统计学意义（P>0.05）。6 GG细胞核中NF-κB P65与TNF-α和IL-6相关性分析:NF-κB P65与TNF-α和IL-6浓度呈明显正相关,r值分别0.886、0.862,P值均为0.000。7 GG中NF-κB P65与AHI和Sa O2相关性分析:NF-κB P65与AHI成正相关,r值为0.722,P值为0.000;NF-κB P65与SaO2成负相关,r值为-0.685,P值为0.000。结论:1 OSAHS会引起颏舌肌中NF-κB活化增加,TNF-α、IL-6浓度升高,这些炎症指标水平的上升可能是颏舌肌疲劳性增加的机制之一。2下颌前移矫治器（MAD）治疗OSAHS可减少颏舌肌中NF-κB的活化,降低TNF-α、IL-6浓度,对颏舌肌起保护作用。