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研究背景上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)作为妇科常见恶性肿瘤之一,其病死率居妇科恶性肿瘤首位。由于EOC发病位置隐匿,缺乏早期特异性诊断指征,约70%患者发现时已处于晚期。目前,EOC患者的标准治疗方案是外科手术加以铂类为基础的化疗,虽然手术和化疗方案不断改进,但是晚期EOC患者仍有80%的复发风险,究其原因主要是由于肿瘤细胞化疗耐药的产生。因此探究EOC化疗耐药产生的相关机制以及分子调控网络,并制定有效的防治措施成为改善EOC患者预后的首要任务。O-GlcNAc修饰是一种蛋白的翻译后修饰方式,参与细胞内多种蛋白的修饰。研究发现O-GlcNAc修饰的异常与多种肿瘤的发生发展以及预后相关,但是O-GlcNAc修饰在EOC化疗耐药中的研究相对较少。自噬作为一种自我保护机制能够帮助细胞抵抗外界恶劣环境,正是这种自我保护能力增加了肿瘤细胞对化疗药物的耐受性,但是化疗耐药过程中自噬增强的相关机制目前尚不清楚。研究发现参与调控自噬溶酶体形成的SNAP-29蛋白能被O-GlcNAc所修饰,SNAP-29主要通过与Stx17和VAMP8结合形成SNARE复合体介导自噬小体和溶酶体的融合过程。但是SNAP-29的O-GlcNAc修饰水平是否影响卵巢癌细胞的自噬目前尚不清楚。综合上述背景,我们提出科学假设:EOC化疗耐药形成过程中,SNAP-29的O-GlcNAc修饰减少,促进其与Stx17和VAMP8结合形成SNARE复合体,介导自噬溶酶体的形成,继而增强细胞自噬水平,提高卵巢癌细胞的化疗耐药性。研究目的通过临床标本分析O-GlcNAc、OGT和OGA在EOC中的表达情况,明确三者表达量与化疗耐药的相关性,探究OGT介导的O-GlcNAc修饰对卵巢癌细胞化疗耐药的影响,阐明自噬在O-GlcNAc修饰介导的EOC化疗耐药中的作用及其相关分子机制。研究方法1.检测EOC临床标本中糖基化相关蛋白的表达水平。收集EOC临床标本,按照化疗效果分为耐药组和敏感组,比较两组患者年龄、肿瘤分期和病理类型有无差异;利用免疫组化检测O-GlcNAc、OGT和OGA的表达水平,统计学分析三者在两组标本中表达有无差异。2.下调OGT对卵巢癌细胞化疗药物敏感性的影响。利用shRNA慢病毒下调卵巢癌细胞内OGT表达水平,建立OGT低表达细胞株,通过Western blot进行验证。首先在体外实验中观察下调OGT对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,然后通过体内体外实验检测下调OGT后卵巢癌细胞对化疗药物敏感性的变化情况。3.下调OGT对卵巢癌细胞自噬的影响。利用Western blot检测OGT下调后自噬相关蛋白的表达情况;利用免疫荧光观察OGT下调后LC3的表达和分布情况;利用LC3双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)感染细胞,观察OGT下调后细胞自噬流的变化情况;通过透射电镜从形态学上观察OGT下调后卵巢癌细胞自噬结构形态和构造的变化情况。4.下调OGT对细胞自噬溶酶体形成的影响。利用自噬溶酶体抑制剂Baf和自噬小体抑制剂3-MA分别抑制细胞自噬后,观察OGT低表达细胞对顺铂敏感性的变化情况,并比较两组有无差异;通过转染mRFP-LC3质粒,荧光共定位检测mRFP-LC3和溶酶体标志物Lamp1的共定位情况,明确下调OGT对自噬溶酶体形成的影响。5.OGT通过SNAP-29调控细胞自噬。通过siRNA技术下调SKOV3细胞的SNAP-29表达水平,Western blot进行验证;通过Western blot检测下调SNAP-29后自噬相关蛋白的表达情况;通过LC3荧光双标检测下调SNAP-29后自噬流的变化情况;转染SNAP-29-GFP和RFP-LC3质粒,检测OGT下调前后SNAP-29与LC3的共定位情况。6.SNAP-29的O-GlcNAc修饰水平影响SNARE复合体形成。通过Western blot检测下调OGT对SNAP-29表达量的影响;通过Co-IP检测下调OGT对SNAP-29的O-GlcNAc修饰水平的影响。构建SNAP-29的O-GlcNAc修饰位点突变质粒,与对照组质粒分别转染细胞,通过Co-IP检测SNAP-29的O-GlcNAc修饰水平的变化情况,通过Western blot检测细胞自噬相关蛋白,通过荧光共定位检测SNAP-29和LC3的共定位情况,通过Co-IP检测SNAP-29与Stx17和VAMP8的结合情况。研究结果1.耐药组标本中O-GlcNAc表达降低。对比耐药组和敏感组临床资料,两组年龄、肿瘤分期和病理类型无统计学差异。相对于敏感组,耐药组O-GlcNAc和OGT表达水平明显降低,OGA表达水平两组之间无统计学差异。2.下调OGT增强卵巢癌细胞的顺铂耐药性。通过携带OGT shRNA的慢病毒感染卵巢癌细胞(A2780和SKOV3),成功建立OGT低表达细胞株。CCK8检测发现下调OGT对卵巢癌细胞增殖无影响,但给予顺铂处理后下调OGT能够降低顺铂对卵巢癌细胞的增殖抑制作用。流式细胞术检测发现下调OGT对卵巢癌细胞的凋亡无影响;当用顺铂处理细胞后,检测细胞凋亡发现OGT低表达的卵巢癌细胞的凋亡率明显降低。CCK8和流式细胞术检测发现下调OGT后不影响卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。裸鼠荷瘤实验结果与细胞学实验结果一致,下调OGT不影响肿瘤的生长速度,但是能够增加卵巢癌的顺铂耐药性。3.下调OGT增强卵巢癌细胞自噬水平。Western blot检测发现下调OGT后卵巢癌细胞内p62水平明显降低,而LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明显增高;免疫荧光检测发现下调OGT后LC3荧光颗粒明显增多;LC3荧光双标检测发现下调OGT的卵巢癌细胞中的红色荧光点明显增加;透射电镜检测发现顺铂处理后OGT低表达细胞内自噬泡明显增多。4.下调OGT促进卵巢癌细胞内自噬溶酶体的形成。Baf和3-MA处理细胞后,CCK8和流式细胞术检测发现下调OGT引起的细胞顺铂耐药被部分逆转,其中Baf作用更加明显;荧光共定位检测mRFP-LC3和Lamp1的共定位情况,发现下调OGT后LC3与Lamp1的共定位增多。5.OGT通过SNAP-29调控细胞自噬。通过siRNA技术下调SKOV3细胞内SNAP-29表达水平,Western blot检测发现下调SNAP-29后细胞内p62蛋白表达量增多,LC3-Ⅱ和Ⅰ表达量均增多;通过LC3荧光双标检测下调SNAP-29后自噬流的变化情况,发现OGT低表达细胞内GFP+RFP+荧光颗粒明显增多,自噬流受阻;转染SNAP-29-GFP和RFP-LC3质粒,荧光共定位检测发现OGT下调后SNAP-29与LC3的共定位明显增多。6.SNAP-29的O-GlcNAc修饰水平影响SNARE复合体形成。Western blot检测发现下调OGT后不影响SNAP-29的表达量,但是降低了 SNAP-29的O-GlcNAc修饰水平。突变SNAP-29蛋白的O-GlcNAc修饰位点后,SNAP-29与Stx17和VAMP8的结合增多,细胞自噬水平升高。研究结论1.O-GlcNAc和OGT表达水平与EOC化疗耐药相关,下调OGT能够增强卵巢癌细胞的顺铂耐药性。2.下调OGT通过促进自噬溶酶体的形成诱导细胞自噬,从而增强卵巢癌细胞的顺铂耐药性。3.下调OGT引起SNAP-29蛋白的O-GlcNAc修饰水平降低,促进其与Stx17和VAMP8结合形成SNAP-29-Stx17-VAMP8复合体,从而介导自噬小体和溶酶体的融合,促进自噬。