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豆粕具有较高的粗蛋白含量和较为均衡的氨基酸组成,是目前使用最广泛的植物源性蛋白饲料之一,但是豆粕中含有的大分子蛋白,影响了动物的吸收,降低了饲料利用率,严重时还会导致动物腹泻。目前对豆粕中大分子蛋白的处理方法主要有物理法、化学法和生物发酵法,其中发酵法是最有前景的处理方法。发酵豆粕的关键,一是所用的菌种,二是发酵过程。本研究以本实验室保存的乳酸菌作为出发菌株,从中筛选出高产蛋白酶、生理生化性能优良、有良好的耐胆盐、耐胃肠道不良环境且具有广谱抑菌性等综合性能优良的乳酸菌,并将其应用到豆粕中进行发酵,考察发酵30 d过程中其对豆粕发酵过程中微生物多样性、豆粕的发酵品质和化学成分及大分子蛋白降解情况的影响,以期为筛选能够应用于豆粕发酵的乳酸菌提供菌种资源,并为探索豆粕发酵体系参考。1、本研究取郑州大学河南省离子束生物工程重点实验室中保存的分离自饲料草、青贮饲料、仔猪粪便等的500余株乳酸菌,接种到固体MRS培养基中培养48 h活化两代后,分别采用打孔法和福林法进行产蛋白酶菌株的初筛和复筛,发现蛋白分解圈直径最大、酶活力最高的6株菌分别是ZZUPF95、P15、P24、ZZUPF94、LAO53和LAO49;在0.2%的胆盐浓度、模拟的人工胃液(p H 3.0)与肠液中(p H 7.5)处理3 h后,上述6株菌的活菌数仍能保持在10~7cfu/m L;经过温度及p H生长范围试验,发现以上菌都能够在4～50℃及p H值3.0～10.0条件下生长,且对大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)有抑制作用;经过16S r RNA和rec A基因序列分析,菌株ZZUPF95被鉴定为食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria),P15、P24和ZZUPF94为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum),LAO49被鉴定为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum),LAO53为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。通过上述筛选,最终确定产蛋白酶活性高、生理生化性能优良、抑菌能力强、耐胆盐、在胃肠道中活性高等综合性能最优的菌株ZZUPF95和P15,作为下一步发酵豆粕的菌剂。2、将ZZUPF95和P15菌株培养至对数期后,按2%的接种量添加到市售豆粕中进行豆粕发酵试验。本试验共设了5个组:空白组(豆粕无添加菌株)、ZZUPF95组(豆粕+ZZUPF95)、P15组(豆粕+P15)、混菌组(豆粕+P15+ZZUPF95)和酸性蛋白酶组(豆粕+蛋白酶),分别在室温下厌氧发酵0、12、24、36、48、60和72 h及7、12、18和30 d后,对相应的发酵豆粕开封进行微生物含量、发酵品质、化学成分及蛋白质分子降解情况分析。其中,微生物含量采用平板培养法、有机酸利用高效液相色谱、豆粕粗蛋白成分通过凯氏定氮法、粗脂肪用索氏抽提法、粗纤维用纤维测定仪、蛋白降解情况利用SDS-PAGE进行分析。由结果可知,所有组发酵豆粕在发酵60 h时达到最佳,乳酸菌成为发酵体系的优势菌株,乳酸含量达到最高值,大分子蛋白由80 Kda降解到20～30 Kda,粗蛋白和粗脂肪含量增加而粗纤维含量下降;ZZUPF95组发酵48 h后乳酸菌菌数达到5.31×10~9,蛋白质分子量由80 Kda左右降到20～30 Kda之间;P15组的粗蛋白含量比对照组提高了25.48%,达到显著水平,粗纤维相比下降了35.92%,而粗脂肪增加了16.2%;混菌组在发酵72 h时将p H值降低到4.5,并在整个发酵周期都保持在该水平;在发酵30 d时,ZZUPF95、P15和混菌组的乳酸含量分别为1.988、1.724和2.125 mg/m L,而空白组、蛋白酶组则分别为0.727和0.838 mg/m L,乳酸菌组的豆粕在发酵30 d的乳酸水平显著高于对照组。由上可知,尽管在60h时豆粕的发酵品质达到了最佳,但是在30 d时,乳酸菌处理组依然保持着较高的乳酸水平,因此,本研究也为延长发酵豆粕的保存时间提供参考。