柑橘粉虱Dialeurodes citri(Ashmead)别名橘黄粉虱,不仅是柑橘类的重要害虫之一,还经常为害栀子、女贞、丁香和柿等多种植物。近年来在我国柑橘产区均有分布,危害严重。柑橘粉虱主要以幼虫为害柑橘幼嫩叶片的背部,吸食汁液。该虫排泄出的蜜露覆盖在叶片和果实表面上,呈现出黑褐色斑点,引发煤烟病。严重时,引起植株叶片变黄、脱落,导致整体树势变弱、果品变差。由于不同地区柑橘粉虱一年中发生期不整齐,且世代重叠,因此在危害严重时,仍然以化学农药防治为主。蜡蚧菌(Lecanicillium lecanii)是重要的生防真菌之一,主要寄生在蚜虫、粉虱、介壳虫类和螨类等上,可以在昆虫种群中引发流行病。很多研究人员的试验结果显示,在穿透昆虫体壁过程当中虫生真菌的几丁质酶有着特定的作用,因此把它当作虫生真菌的一个重要的毒力因子。研究表明,应用基因超表达技术可以强化虫生真菌毒力因子,提高虫生真菌对寄主的毒力,可以在短期内达到击倒害虫的效果,从而有效地推广农业害虫的生物防治方法。本学位论文以蜡蚧菌为研究对象,利用ClonExpress技术成功构建了蜡蚧菌几丁质酶基因超表达载体(pRCy1::Tchit1)和球孢白僵菌几丁质酶基因超表达载体(pRCy1::Bchit2),并通过农杆菌介导转化法将几丁质酶基因转入蜡蚧菌中。研究结果有助于提高蜡蚧菌对柑橘粉虱的毒力,并为该菌在农业生产生物防治方面提供理论基础。本学位论文的主要研究结果如下：1.2种几丁质酶基因超表达载体的构建首先提取蜡蚧菌总RNA,并反转录合成第一链cDNA。然后,设计两端分别带有酶切位点(XhoI和Xbal)序列的引物,并扩增该基因完整的开放阅读(ORF),扩增的Tchit1基因序列与NCBI上登录的蜡蚧菌几丁质酶基因chit1的序列相比,同源性为100%。再采用ClonExpress技术,将蜡蚧菌几丁质酶基因Tchit1的开放阅读框定向插入到丝状真菌表达载体pRCy1上,构建出蜡蚧菌几丁质酶基因超表达载体(pRCy1::Tchit1)。以同样的方法构建出球孢白僵菌几丁质酶基因超表达载体(pRCy1::Bchit2)。扩增的Bchit2基因序列与NCBI上登录的球孢白僵菌几丁质酶基因chit2的序列相比,同源性为99%。2.农杆菌介导的蜡蚧菌的转化及验证首先将蜡蚧菌几丁质酶基因超表达载体(pRCy1::Tchit1)和球孢白僵菌几丁质酶基因超表达载体(pRCy1::Bchit2)分别转入AGL1农杆菌感受态细胞中,并对农杆菌转化子进行菌液PCR验证和质粒双酶切验证。验证结果正确后,通过农杆菌介导转化法将Tchit1和Bchit2基因分别转入蜡蚧菌TL001菌株中。再对蜡蚧菌假定转化子进行PCR和RT-PCR验证,结果表明,Tchit1和Bchit2基因已经成功导入TL001菌株中,阳性转化子能正常转录。遗传稳定性验证结果表明,转化子中插入的几丁质酶基因片段能够稳定遗传。3.蜡蚧菌阳性转化子几丁质酶酶活测定将蜡蚧菌阳性转化菌株和野生菌株分别接种在蝉蜕培养基平板上,28℃诱导培养2代后,提取其粗酶液。依据绘制的ELISA标准曲线和样品的OD值,计算出待测样品的几丁质酶活性。酶活测定结果表明,蜡蚧菌转基因菌株TTL001、BTL001和野生菌株TL001中几丁质酶酶活分别为10.21 U/L、2.69 U/L和0.25 U/L。转基因菌株中几丁质酶超量表达,并具有酶活性,而野生菌株几乎无几丁质酶活性。