锌指核酸酶（zinc finger nuclease,ZFN）作为基因修饰的工具之一，目前发展已日趋成熟，在多个研究领域内得到了广泛的应用，其中在基因治疗方面的应用最为突出，同时也是最具潜力的。与TALEN和CRISPR/Cas9基因组编辑系统相比，ZFN具有脱靶效率低，细胞毒性小等优势，赋予其在基因治疗领域占有较大的优势。目前ZFN技术在基因治疗上的应用已进入临床试验阶段，但ZFN的构建、筛选的复杂性使其较其他基因修饰工具更为耗时，而研究缩短其构建、筛选时间的方法就显得更为有意义。研究表明ZFN的锌指结合特异性的靶序列，然后利用与之相融合的非特异性核酸内切酶FOKⅠ来切割目标序列，产生DNA双链切口（double strand breaks，DBS），再利用供体DNA经过同源重组（homologous recombination，HR)修复DNA或通过非末端连接修复（non-homologous end joining，NHEJ)系统引入插入缺失突变。ZFN技术的重点在于如何简单构建出大量有效锌指。目前研究中出现过的构建ZFN的方法主要有模块装配法（ModularAssembly，MA），相邻装配法（Context-dependentAssembly，CoDA），以及目前最常用到的开源式方法，又叫寡聚化池工程法（Oligomerized PoolEngineering,OPEN，OPEN）。其中利用模块装配得到的锌指效率普遍较低，并且忽视相邻碱基的影响，CoDA方法则限制了位于中间的锌指的作用，只能获得有限的锌指，OPEN方法虽然没有前两种的缺点，但是在建立库后的筛选工作量大且复杂，因此也受到了限制，现在要获得高效ZFNs的关键就在于解决这些方法中存在的一些缺点。综合所有方法的优缺点，我们针对OPEN筛选方法对其进行了改进。结合相关文献报道，我们知道在OPEN法筛选ZFNs时主要可用到细菌双杂交系统，酵母双杂交系统等，其中细菌由于生长周期比酵母短，可以相对节约时间。传统的OPEN方法中的细菌双杂交系统主要建立在LacZ报告基因的蓝白斑筛选基础上，需要挑取单个克隆，并对每一个克隆进行检测，该工作量即为整个实验中耗时最长的部分。我们以组氨酸合成酶His3基因替换半乳糖苷酶LacZ作为筛选的报告基因。3-氨基-1,2,4-三氮唑（3-Amino-1,2,4-triazole，3-AT），3-AT是组氨酸合成酶的竞争性抑制剂，而研究证明3-AT能明显抑制组氨酸合成酶，能够达到抑制组氨酸（histidine，His）的本底表达。因此我们可将表达His3报告基因置于DNA靶位点下游，当锌指蛋白结合靶位点，其融合的转录因子启动His3基因表达，克隆中含有活性锌指蛋白的载体即可在含3-AT的缺陷性培养基中生存，而此时基因的本地表达被抑制，提高筛选获得的阳性克隆结合靶序列的效率。再构建ZFNs表达载体，在酵母细胞水平检测筛选获得的ZFNs切割靶DNA的活性，分离得到目的ZFNs的同时可达到验证其效应的目的。通过以上试验方式进行研究得到了3个靶基因共9对有活性的ZFNs，且有效缩短了筛选的时间，从库中筛选得到有效ZFNs的整个过程仅需要5周时间相较传统的蓝白斑筛选能节约至少一倍的时间。试验结果充分说明了本研究方法能够达到缩短时间的目的，优化的OPEN方法构建ZFNs更加简便。