黄芩苷联合连翘苷对甲型流感病毒核蛋白基因表达影响的体外实验研究

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目的:初步探讨黄芩苷联合连翘苷对甲型流感病毒核蛋白基因(NP基因)表达的影响,为寻找高效的抗流感病毒中药复方提供理论和实验依据。方法:1.采用细胞病变法(CPE)测试药物(黄芩苷、连翘苷)对Hela细胞的最大无毒浓度,确定各种药物的实验浓度;2.甲型流感病毒NP真核表达载体pc DNA3.1(+)/NP运用脂质体法转染Hela细胞,作为实验用靶细胞,反转录-实时荧光定量PCR(RT-q PCR)确定成功转染Hela细胞;3.反转录-实时荧光定量PCR(RT-q PCR)评价黄芩苷联合连翘苷对靶细胞NP基因表达的影响,运用统计学相关软件进行分析;4.反转录-实时荧光定量PCR(RT-q PCR)评价不同浓度黄芩苷、连翘苷对靶细胞NP基因表达的抑制作用,并计算黄芩苷、连翘苷对靶细胞的半数抑制浓度(IC50);5.反转录-实时荧光定量PCR(RT-q PCR)评价IC25、IC50剂量的黄芩苷联合IC25、IC50、IC75剂量的连翘苷对靶细胞NP基因表达的联合作用效果(协同、相加、拮抗)。本实验设Hela细胞组、脂质体组、重组质粒转染组(转染pc DNA3.1(+)/NP)、黄芩苷组、连翘苷组、黄芩苷联合连翘苷组。结果:1.细胞病变法得出各种药物的最大无毒浓度分别为:黄芩苷:31.25μg·ml-1,连翘苷:25μg·ml-1;实验浓度:黄芩苷:15.625μg·ml-1,连翘苷:12.5μg·ml-1;且黄芩苷(15.625μg·ml-1)联合连翘苷(12.5μg·ml-1)显示无毒。2.重组质粒转染组NP基因表达量明显高于Hela细胞组,差异具有显著统计学意义(t=7.742,P<0.01);重组质粒转染组NP基因表达量明显高于脂质体组,差异具有显著统计学意义(t=7.802,P<0.01);说明流感病毒真核表达载体pc DNA3.1(+)/NP成功转染Hela细胞。3.黄芩苷(15.625μg·ml-1)联合连翘苷(12.5μg·ml-1)组NP基因表达量明显低于重组质粒转染组,差异具有显著统计学意义(t=6.966,P<0.01)。4.在一定浓度范围内,黄芩苷、连翘苷对靶细胞NP基因表达有明显的抑制作用,且抑制作用呈浓度依赖性;黄芩苷、连翘苷对靶细胞NP基因表达的IC50分别为:10.4627μg·ml-1,4.16832μg·ml-1。5.低浓度、中浓度黄芩苷(IC25、IC50)联合低浓度、中浓度、高连翘苷(IC25、IC50、IC75)对靶细胞NP基因表达的抑制作用CI值分别为:IC25黄芩苷+IC25连翘苷:1.24169;IC25黄芩苷+IC50连翘苷:0.95414;IC25黄芩苷+IC75连翘苷:0.94745;IC50黄芩苷+IC25连翘苷:0.89460;IC50黄芩苷+IC50连翘苷:0.85482;IC50黄芩苷+IC75连翘苷:0.89201。低浓度黄芩苷联合低浓度连翘苷起拮抗作用CI>1;余浓度联合起协同作用CI<1。结论:黄芩苷联合连翘苷能够下调转染Hela细胞的甲型流感病毒NP基因表达量,并且在一定浓度范围内显示出协同作用。
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