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β-葡聚糖酶是一类能够将葡聚糖降解为葡萄糖的水解酶类,我们已知的β-1,3-葡聚糖酶都是糖基水解酶的第17家族。β-1,3-葡聚糖酶是植物中最重要的抗真菌病害的抗性物质之一,众多体外研究表明,β-1,3-葡聚糖酶能降解真菌的细胞壁并且抑制真菌生长,对植物的抗真菌病害起着重要作用。β-1,3-葡聚糖酶还对谷物中β-葡聚糖的水解具有重要的作用,已经在啤酒、饲料等生产中得到广泛应用。本试验对栖热袍菌DSM4359β-葡聚糖酶进行克隆,将其在大肠杆菌中进行体外表达,并对该酶的部分酶学性质进行研究。首先,参考Gene Bank中栖热袍菌DSM4359β-葡聚糖酶的基因序列,依据表达载体质粒pET-28a(+)的特点设计引物。然后以提取的DSM4359β-葡聚糖酶基因组DNA作为模板,通过上下游引物,利用PCR技术扩增出大小约为0.8kb的产物,之后对该产物进行TA克隆并测序。将目的片段与表达质粒载体pET-28a(+)双酶切,然后用DNA连接酶连接构建重组质粒。将重组质粒转化到感受态细胞大肠杆菌DH5a中,培养后提取质粒,对其进行双酶切,得到两个大小分别为5.4kb及0.8kb的片段,初步判定β-葡聚糖酶克隆成功。重组子序列经测序鉴定与原来的完全一致,大小为825bp,编码274个氨基酸。克隆成功后将重组质粒转化到宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中得到工程菌B-tndex。工程菌诱导后进行SDS-PAGE鉴定,出现约为62KDa的清晰条带,目的蛋白表达成功。本试验中的β-1,3-葡聚糖酶对热有较好的耐受性,因此可先将粗酶在70℃热处理30min进行初步纯化；因其羧基端上携带有6xHis标签,可利用Ni-NTA亲和柱层析进一步纯化该酶。将纯化的酶进行SDS-PAGE检测,结果出现单一的清晰条带。本试验以羧甲基纤维素钠为底物探索了该酶的部分酶学性质,发现其最适反应温度为70℃、最适反应pH为5.0、最佳反应时长为2.5h。