前言：　　研究表明，大多数人体实体瘤存在不同程度的低氧。低氧能够诱导肿瘤细胞产生低氧诱导因子（HIF1-α），使肿瘤细胞侵袭能力增强并产生新生血管，易于向远处转移。低氧还能诱导肿瘤细胞抗化疗、抗放疗，与肿瘤患者的预后密切相关。有关HIF1-α的研究成为肿瘤研究的热点。到目前为止发现受HIF1-α调控的基因至少有30多种，其中，有关血管内皮细胞生长因子(VEGF)研究较多，而另一重要基因CXCR4(Chemokine CXC Receptro4)是近年由研究爱滋病而被发现，之后被发现与肿瘤转移密切相关而倍受关注的基因。许多研究指出，CXCR4与人体多种肿瘤的浸润转移有密切相关。在肿瘤细胞转移中它起着导向、驱动和定位的作用，是肿瘤转移的“归巢学说”的有力证据。但有关CXCR4与低氧的关系研究不多，也未见上颌窦癌细胞CXCR4和HIF1-α表达的研究。为探讨低氧对头颈部肿瘤细胞的影响，本研究对低氧下上颌窦癌细胞IMC3的CXCR4和HIF1-α的表达作了分析。　　材料与方法：　　1.培养细胞上颌窦癌细胞IMC3进行低氧培养，低氧时间分6小时，12小时、24小时、48小时几个时间段，并用LY294002进行阻止试验。　　2.RNA的提取，浓度测定及逆转录　　对上述不同时间段的总RNA进行提取，并浓度测定，-80℃冰箱保存。　　3.Real-Time PCR实时定量测定IMC3的CXCR4、HIF1-α的mRNA表达。　　CXCR引物序列:Forward:5-GCATGACGGACAAGTACAGGCT-3　　Reverse:5-AAAGTACCAGTTTGCCACGGC-3　　HIF1-α引物序列:　　Forward:5-GTCGGAAGCCTCACCAAACAGAGC-3　　Reverse:5-GTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAG-3　　Real-Time PCR设定为三步:　　第一步:50℃×2min　　第二步:95℃×10min　　第三步:(95℃×15sec→60℃×1min)×45cycle　　4.培养细胞的免疫组化测定:应用CXCR4抗体分别对低氧24小时的细胞和正常状态的细胞进行免疫组化检测，显微镜下观察细胞染色情况。　　5.蛋白质的提取并浓度测定。对不同低氧时间的培养细胞提取蛋白质。　　6.Western Blotting测定正常状态与不同低氧时间下的HIF1α的蛋白质表达。 HIF1-α抗体稀释250倍后杂交。　　7.用秩和检验进行统计学分析，P＜0.05为有统计学差异。　　结果：　　1.低氧诱导了IMC3细胞CXCR4 mRNA的表达，并随低氧时间延长而增高，有明显时间性（Time Course）。正常氧状态下，CXCR4 mRNA约为0.035，低氧6h后达0.283，约为常态下的8倍，12h、24h、48h分别达0.313、0.426、0.510。低氧48h是常态下的15倍。除低氧6h和12h一组P＞0.05外，其余各组间P＜0.05，有统计学差异（秩和检验）。　　2.低氧诱导了IMC3细胞HIF1α的mRNA表达，24h低氧使HIF1α表达明显增高，P＜0.05。　　3.免疫组化结果显示低氧24h后，CXCR4的蛋白质表达明显增强，常态下染色阴性或微弱阳性。 CXCR4染色主要位于细胞膜、细胞质，少部分在细胞核内表达。　　4.蛋白印迹试验显示，低氧诱导IMC3细胞表达HIF1α增强，HIF1α条带为120kDa，常态下不能测出，低氧12h后可见明显条带，24h、48h则逐渐增强，反映了低氧使细胞内HIF1α蛋白质增加。　　5.磷酯酰肌醇-3激酶(PI3K)的特异性拮抗剂LY294002对低氧诱导的CXCR4及HIF1α的mRNA的表达都有抑制作用（各组间P＜0.05），存在Dose-Dependant，即浓度增加，其抑制作用增强。　　讨论：　　HIF1α是近年来发现在肿瘤和炎症中都具有重要作用的蛋白质，它由低氧诱导产生，也可由炎性因子刺激引起。它半衰期短，正常氧状态下不到10min就降解，但在低氧时可在细胞内大量积聚，从而诱发一系列病理、生理改变。近来的研究表明，HIF1α与肿瘤密切相关。有人研究指出存在低氧-HIF1α-CXCR4轴，HIF1α能调节CXCR4的表达。 CXCR4参与肿瘤细胞的血管重建，对肿瘤的转移起导向作用，是肿瘤的器官特异性转移的基础。许多肿瘤的转移与CXCR4的表达存在明显的关系，正常组织表达少，肿瘤组织高表达，而转移癌则明显表达。由此可见HIF1α、CXCR4可能存在互相作用，共同影响肿瘤细胞的生物学行为。　　Real-Time PCR是近几年发展起来的新技术，它能够实时定量地反映出细胞mRNA的表达情况，准确，自动。 Westen Bloting能够测出细胞微量蛋白的表达。本研究就是运用上述技术对低氧下上颌窦癌细胞IMC3的CXCR4及HIF1α的表达作了研究。得到的资料显示，低氧能够使CXCR4、HIF1α同时在mRNA水平和蛋白质水平上调，CXCR4的上调具有明显时间性，随低氧时间增加而增加。而这种作用能够被PI3K的拮抗剂LY294002所抑制。说明低氧能够诱导IMC3细胞表达CXCR4，而这种上调可能与PI3K细胞信号系统有关。同时，低氧能够诱导上颌窦癌细胞上调表达HIF1α，其HIF1α mRNA水平的表达也能够被LY294002所抑制。在蛋白质水平上，HIF1α随低氧时间的增加而增加。　　综上所述，深入了解低氧引起的IMC3细胞CXCR4和HIF1α表达增高的机理及其他们之间的相互作用，有助于揭开肿瘤转移之谜，同时为肿瘤的治疗带来新靶点。　　结论：　　1.低氧能够诱导IMC3细胞CXCR4 mRNA的表达，CXCR4 mRNA的表达随低氧时间延长而增高，有明显时间性。　　2.低氧能够诱导IMC3细胞HIF1α的mRNA表达。　　3.低氧使IMC3细胞的CXCR4蛋白质表达增强，CXCR4染色主要位于细胞膜、细胞质，少部分在细胞核内表达。　　4.低氧使IMC3细胞内HIF1α蛋白质增加。　　5.PI3K的特异性拮抗剂LY294002对低氧诱导的CXCR4及HIF1α的mRNA的表达都有抑制作用。