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糖尿病(DM)是严重危害全球人类健康的慢性疾病,其中2型糖尿病(T2DM)占糖尿病患者的90%以上。前人研究发现GIP的功能受损是T2DM发病机制的一个重要因素,GIPR是GIP发挥作用的关键。GIP/GIPR信号影响血糖水平及胰岛素应答,显性抑制型GIPR(GIPRdn)基因的表达阻碍GIP/GIPR信号传递。本研究克隆大鼠胰岛素2启动子(RIP2),人工合成人GIPR基因和显性抑制型GIPR(GIPRdn)并构建pLV RIP2-GIPR、pLV-RIP2-GIPRdn载体并包装慢病毒,同时利用GIPR/GIPRdn的慢病毒感染胰岛β细胞,分析GIPRdn通过GIP/GIPR/PKA信号通路对β细胞胰岛素分泌的影响,为后续建立GIPR功能显性抑制的T2DM转基因动物模型奠定基础。根据GenBank公布的鼠INS2基因启动子序列设计引物,PCR扩增RIP2序列并进行生物信息学分析,同时将RIP2序列插入不含启动子的EGFP-1载体构建EGFP-1-RIP2载体,利用βTC-6、C2C12和PK15细胞对RIP2序列的启动子功能进行验证。结果发现克隆获得703bp的RIP2序列与参考序列的同源性为99%,有3处碱基差异;软件预测RIP2序列有2段可能为转录启动子区域的序列和启动子核心元件TATA框、CAAT框;细胞转染结果显示RIP2序列能够特异性在βTC-6细胞中启动绿色荧光蛋白的表达。合成的人正常GIPR基因和GIPRdn基因序列分别插入pLV慢病毒表达载体,同时RIP2序列替换pLV载体的CMV启动子序列,重组构建pLV-RIP2-GIPR、pLV-RIP2-GIPRdn载体;重组质粒和包装包膜质粒共转染293T细胞包装慢病毒并进行病毒浓缩、滴度测定及感染βTC-6细胞。实验结果显示,构建的pLV-RIP2-GIPR、pLV-RIP2-GIPRdn载体和包装浓缩获得滴度为2× 107TU/ml携带GIPRdn和GIPR基因的慢病毒感染βTC-6细胞均有较亮的绿色荧光表达,并且都能检测到GIPR和GIPRdn基因的表达。携带GIPR和GIPRdn基因的慢病毒分别感染βTC-6细胞,并用含GIP激素的培养基培养βTC-6细胞,48h和72h后收集细胞和细胞培养液,qPCR、Western Blot和ELISA检测分析在β细胞中过表达GIPR和GIPRdn基因对细胞胰岛素分泌调控作用的影响。qPCR结果显示,相对于对照组,在GIP作用的βTC-6细胞中过表达GIPR基因能够促进INS基因的表达;过表达GIPRdn基因会抑制Gnabl、PKACα-1、CREB和PDX-1基因的表达量,使得INS基因的表达水平没有变化。Western Blot检测结果显示,过表达GIPR增加了 PDX-1、总CREB、p-CREB和INS蛋白的表达水平,而过表达GIPRdn降低PDX-1、总CREB、p-CREB和INS蛋白的表达水平。ELISA结果显示,病毒感染48h,培养液中胰岛素浓度无显著性变化,感染72h时,过表达GIPR基因的细胞培养液中胰岛素浓度显著地高于对照组,而过表达GIPRdn基因的细胞培养液中胰岛素浓度显著地低于对照组。因此,携带GIPRdn基因的慢病毒感染β细胞,能竞争性的抑制GIP-GIPR-PKA信号通路基因表达,降低β细胞胰岛素的分泌。