卵巢癌病死率目前仍旧位居妇科恶性肿瘤第一位,美国国家健康统计中心最新公布的报告显示,回顾卵巢癌近期的总5年生存率为46%,而其中的晚期病例5年生存率仅为29%。初次手术后给予紫杉醇联合铂类化疗被认为是卵巢癌一线治疗方案。在这种治疗方案中,由于手术不能做到完全切除肿瘤组织,特别是对于晚期病例,因此化疗被认为是该治疗方案中的一项独立因素。尽管一线化疗方案的近期缓解率已经达到80%以上,但是短期内卵巢癌患者复发的风险依然很高,而一旦复发几乎所有的复发性卵巢癌对再次化疗产生耐药性。因此化疗耐药已经成为卵巢癌患者治疗失败和死亡的最主要原因之一。紫杉醇作为卵巢癌治疗的一线化疗药物,也广泛应用于其他实体肿瘤的化疗,但其总体反应率仅为20-40%。尽管已有部分研究揭示了紫杉醇的耐药机制,然而肿瘤细胞对紫杉醇产生耐药依然是影响其临床应用的重要原因。目前研究已经阐明的肿瘤紫杉醇耐药机制包括:多药物转运体P糖蛋白的过表达通过ATP依赖的调控机制将紫杉醇泵出肿瘤细胞;微管蛋白异构体构成的变化和微管动力的改变对紫杉醇作用的影响;紫杉醇诱导的凋亡调节蛋白如BCL-2家族蛋白的调控;BUB1B下调导致的纺锤体检查功能的减弱;TXNDC17诱导的自噬增强等。然而基于上述这些机制的逆转紫杉醇耐药的研究仍然进展缓慢。近年来的研究表明,肿瘤细胞对化疗药物敏感性的调控与泛素化修饰相关,其中也包括紫杉醇。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,广泛存在于如蛋白质降解、细胞周期、细胞内信号转导等多种细胞生命活动中。泛素能以共价键与蛋白质相结合,而且一种蛋白质可以和多个泛素结合并形成泛素链,这称之为多泛素化,并以此启动蛋白质的降解。靶蛋白的泛素化涉及3个连续的过程:1.泛素活化酶E1通过与泛素相结合而使其活化,此过程需要以ATP作为能量;2.泛素活化酶E1将活化后的泛素传递给泛素结合酶E2;3.泛素连接酶E3将结合E2的泛素连接到靶蛋白上,并形成多泛素链。由不同的泛素分子赖氨酸残基所构成的泛素链所介导的功能也不一样。经典的泛素化修饰即由K48位赖氨酸残基介导的聚泛素链,参与对靶蛋白的降解;而由K63位赖氨酸残基所介导的聚泛素链则参与非经典泛素化修饰,参与细胞内信号转导和DNA损伤修复等。目前已知的人类基因组编辑的泛素活化酶E1有2种,泛素结合酶E2有38种,而泛素连接酶E3有超过600种。这其中,由于泛素连接酶E3具有一定的底物特异性,能通过对不同的底物进行泛素化修饰而参与调控不同的细胞活动,因此目前对于泛素化修饰和化疗耐药的研究多集中于探索泛素连接酶E3在调控肿瘤细胞化疗敏感性中的作用。然而泛素化修饰和肿瘤化疗耐药之间仍有不少问题需要解决。在本课题组前期的研究中,我们对卵巢癌细胞系SKOV3和其耐紫杉醇细胞系SKOV3-TR30采用双向荧光电泳-质谱联合的定量蛋白质组学技术进行筛选,随后经过Western Blot方法验证,发现了泛素结合酶13(ubiquitin conjugating enzyme 13,UBC13,又称作 ubiquitin conjugating enzyme E2 N,UBE2N)在耐紫杉醇细胞株中表达显著降低。UBC13是泛素结合酶E2家族中的一种,除了能介导K48多泛素链形成参与蛋白质的降解外,UBC13也是唯一能介导K63多泛素链形成并参与细胞内信号转导、DNA损伤修复等。近十几年来,也有研究报道过UBC13与一些肿瘤的发生发展相关,而且也有少数研究报道了 UBC13和肿瘤化疗之间的关系,但是,有关UBC13和紫杉醇之间的关系至今仍不明确。因此基于我们的前期研究基础和目前研究现状,卵巢癌细胞中UBC13的表达降低可能与紫杉醇耐药和泛素化修饰相关。本研究先首先通过Western Blot方法发现UBC13在卵巢癌耐紫杉醇细胞株中表达下降以及紫杉醇诱导卵巢癌UBC13表达下调,并同步下调UBC13潜在的下游分子CHFR。用小干扰RNA干扰UBC13能降低卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性,并同时上调了潜在下游分子DNMT1及AuroraA,而抑制了 CHFR的表达变化,用质粒过表达UBC13则结果相反。然后调控UBC13,发现其能诱导DNMT1泛素化,而调控DNMT1后发现其能诱导CHFR启动子甲基化,而调控CHFR则能抑制Aurora A的表达,进而影响卵巢癌细胞的紫杉醇敏感性。通过免疫组织化学检测发现,卵巢癌组织中UBC13的低表达与卵巢癌患者的化疗耐药、相关高危临床病理参数以及更短的生存期相关。UBC13通过DNMT1、CHFR和Aurora A来调控卵巢癌紫杉醇敏感性。UBC13的表达可作为预测卵巢癌患者化疗反应和预后的指标。第一部分:UBC13调控卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性目的:初步证实UBC13对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的调控作用及可能参与的信号分子。方法:以Western Blot检测卵巢癌紫杉醇敏感细胞和耐药细胞UBC13表达的差异。用Western Blot检测不同浓度紫杉醇刺激后卵巢癌细胞UBC13和CHFR的表达变浙江大学博士学位论文中文摘要化。以小干扰RNA和质粒转染技术调控UBC13表达,以MTS法观察UBC13对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的影响,并以Western Blot方法观察潜在下游分子DNMT1、CHFR和AuroraA的表达变化。结果:1.UBC13在卵巢癌耐紫杉醇细胞中表达减少。2.紫杉醇诱导A2780和SKOV3细胞UBC13表达下调,并同时伴随着CHFR的表达下调。3.siRNA干扰UBC13表达降低A2780和SKOV3细胞对紫杉醇的敏感性,并增加DNMT1表达,减少CHFR表达以及提高AuroraA表达。4.质粒过表达UBC13增强A2780和SKOV3细胞对紫杉醇的敏感性,并减少DNMT1表达,提高CHFR表达以及降低Aurora A表达。结论:1.紫杉醇可诱导卵巢癌细胞UBC13表达下调;反之,调控UBC13表达也可改变卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性。2.DNMT1、CHFR、AuroraA可能参与UBC13对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的调控过程。第二部分:DNMT1/CHFR/Aurora A通路参与UBC13对卵巢癌细胞紫杉醇耐药的调控目的:证明UBC13通过DNMT1-CHFR-AuroraA的参与,调控卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。方法:首先以质粒调控UBC13表达,观察卵巢癌细胞DNMT1泛素化的改变,再在调控UBC13的基础上,予siRNA反向调控DNMT1,观察卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的变化和各分子的表达变化;siRNA干扰DNMT1,观察卵巢癌细胞CHFR启动子DNA甲基化的改变和mRNA表达的变化,再在调控UBC13的基础上,予siRNA或过表达质粒反向调控CHFR,观察卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的变化和各分子的表达变化;最后予不同浓度的紫杉醇对卵巢癌细胞作用不同时间,观察各个分子的表达变化。结果:1.质粒过表达UBC13使DNMT1泛素化增加,shRNA下调UBC13使DNMT1泛素化减少,在下调UBC13的基础上用siRNA干扰DNMT1表达逆转了由UBC13下调所引起的A2780和SKOV3细胞紫杉醇敏感性的减弱和CHFR、AuroraA的表达,不影响UBC13表达。2.siRNA干扰DNMT1减弱了 A2780和SKOV3细胞CHFR启动子DNA甲基化,并增加了 CHFRmRNA的表达。3.在调控UBC13的基础上用siRNA干扰或质粒过表达反向调控CHFR表达,则能逆转由UBC13改变所引起的A2780和SKOV3细胞紫杉醇敏感性的变化和AuroraA的表达,不影响UBC13、DNMT1表达。4.紫杉醇诱导A2780和SKOV3细胞UBC13表达下调,DNMT1表达增高,CHFR表达减少,AuroraA表达升高。结论:1.UBC13通过泛素化修饰调控DNMT1。2.DNMT1通过启动子区DNA甲基化调控CHFR表达。3.CHFR通过AuroraA调控卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。4.DNMT1/CHFR/Aurora A通路参与UBC13对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的调控过程。第三部分:UBC13在卵巢癌组织中的表达及临床意义目的:观察UBC13在卵巢癌组织中的表达并阐明其临床意义。方法:利用免疫组织化学的方法检测UBC13在71例卵巢癌组织中的表达,并分析其与卵巢癌患者的年龄、FIGO分期、肿瘤分级、腹水量、手术前血清CA125水平、初次手术满意度和化疗敏感性等临床病理参数的相关性,以及其对无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)的影响。结果:UBC13在卵巢癌组织中低表达与化疗耐药、更高级别的肿瘤分化、更多的腹水量和不满意的肿瘤细胞减灭术显著相关。UBC13低表达的卵巢癌患者表现为更短的PFS和OS。结论:卵巢癌组织UBC13低表达与紫杉醇耐药和不良预后显著相关,提示UBC13表达可作为预测卵巢癌紫杉醇化疗敏感性和预后的指标,并可能作为新型的分子药物用于卵巢癌治疗。