微创通道下的MIS-TLIF手术在较长时间的观察随访中,可以获得与开放型TLIF相似的临床治疗效果,同时减轻了患者由于手术入路造成的软组织损伤,减缓椎旁肌退变。在获得诸多优势的同时,我们发现即使应用了更为微创的ZISTA通道技术,依旧无法减轻硬膜外纤维化粘连程度,与开放手术无显著性差异。为了探索这一脊柱外科难题,获得一种适用于微创管道化操作、合理设计、安全有效的防治硬膜外纤维化粘连的生物材料就显得十分迫切。因此,我们设计和制作了一种具有温敏性凝胶化、自我修复、组织黏附、抗氧化、抗炎和抗纤维化的多功能水凝胶。这种水凝胶通过超分子方式整合三个功能模块,即温敏性三嵌段共聚物泊洛沙姆407（Poloxamer 407,PX）、广谱活性氧（ROS）清除性抗炎纳米粒（TPCD NP）和具有增强黏附能力的鞣酸（TA）来方便地构建。在治疗上,PXNT水凝胶在局部能够有效的防治大鼠和家兔椎板切除术后硬膜外纤维化粘连。PXNT水凝胶显现出比PLGA-PEG-PLGA温敏凝胶和一种商品化防粘连膜更好的效果。机制上,PXNT水凝胶能显著减轻局部氧化应激,抑制炎症反应,减少纤维化组织的形成。此外,局部使用PXNT水凝胶不会引起全身不良反应和神经功能损害。方法1.锥形通道下MIS-TLIF手术的临床结果及术后硬膜外纤维化评价回顾性分析锥形通道系统下MIS-TLIF手术与开放TLIF手术病例的围手术期参数及术后疗效对比。通过MRI评估椎旁肌脂肪浸润和术后硬膜外纤维化粘连程度。2.PXNT防纤维化粘连水凝胶的筛选和制备a)TPCD纳米粒的制备和表征制备TPCD纳米粒。观察纳米粒透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）图像,测定其粒径分布。b)具有生物黏附、抗炎、温敏性防纤维化粘连水凝胶的配方筛选质量比为16、18和20wt%的Poloxamer 407（PX）溶液率先纳入实验,这三种溶液在37°C时均可快速凝胶化。依照0.2、1和5mg/ml浓度将TPCD NP加入不同质量比的PX溶液之中。由此实验分组为模型组、PX16-NP0.2、PX16-NP1、PX16-NP5、PX18-NP0.2、PX18-NP1、PX18-NP5、PX20-NP0.2、PX20-NP1和PX20-NP5组。随后各凝胶在大鼠腰椎板切除模型中应用,观察TPCD纳米粒对于局部生物功能的影响,同时测定各组凝胶溶液的溶胶-凝胶转相能力。基于上述结果筛选出最佳TPCD纳米粒治疗浓度。最后,将不同质量比鞣酸（TA）加入筛选后的PX-NP水凝胶。观测加入鞣酸后水溶液的凝胶转相能力,确定鞣酸最高浓度阈值,低于阈值浓度分梯度进入生物黏附性实验。生物黏附测试分两部分,使用自制斜坡平台测定牛硬膜组织黏附能力,以及使用材料试样机测定肌肉搭接黏附剪切应力。最后,通过以上实验筛选出最优配比水凝胶,简写为PXNT。同时制备PXN、PXT、PLN、PL和PX水溶液用于后续对照。3.PXNT防纤维化粘连水凝胶的表征a)采用试管倒置法测定PXNT的溶胶-凝胶转相。b)使用共聚焦显微镜观察PXNT水凝胶的荧光图像（FITC标记PX和Cy5标记TPCD NP）。c)不同配比样品冻干后,在红外光谱仪上记录傅里叶变换红外光谱（FT-IR）。d)各组水凝胶样品冻干并喷金后,使用扫描电镜（SEM）观察凝胶表面及其断裂面的内部结构。e)使用固定平行板（直径40mm;间隙0.05mm）对各组水溶液进行流变学测定。分别进行温度依赖溶胶-凝胶转相实验、G′和G″随时间变化实验、角频率依赖G′和G″变化（Tanб为G″与G′的比值）、震荡应变扫描测试、阶梯应变测试、粘度随剪切率变化测试和阶梯剪切率粘度变化测试。f)体外水解试验,预热至37℃的0.9%生理盐水分别加入PXN和PXNT凝胶。预定时间点测定去上清后凝胶重量,再加入生理盐水。重复直至完全水解。g)体内残留实验,将Cy7.5标记的PXN和PXNT水溶液注射到大鼠骶棘肌深部。预定时间点活体成像系统成像。软件分析荧光强度。h)PXNT水凝胶体外释放,Cy5标记TPCD NP分散在PXT溶液中,生理盐水加入标记后PXNT凝胶,每日更换上清液,荧光光谱仪测量上清液荧光强度,计算累积释放率。此外,使用粒度仪测定上清液TPCD NP粒径分布。4.PXNT防纤维化粘连水凝胶在动物腰椎板切除模型中的疗效评价a)建立大鼠腰椎板切除模型。分组为:模型组、PXNT、PXN、PXT、PLN、PL和PX组。L4椎板切除后,不同制剂喷涂于硬膜上完全覆盖。8周后,钆增强小动物核磁共振评价硬膜外组织纤维化程度。之后处死动物,对手术部位进行大体观评分并进行H&E和Masson染色,进行组织学分析。b)在大鼠腰椎板切除模型中使用PXNT凝胶与Interceed防粘连膜。进行钆增强小动物核磁共振分析,大体观察评分,组织切片进行H&E和Masson染色并分析。c)在家兔腰椎椎板切除模型中应用PXNT水凝胶,并与模型组进行钆增强核磁共振图像相关分析和大体观评分对比。5.PXNT防纤维化粘连水凝胶防治椎板切除后硬膜外纤维化粘连的机制探索a)将无菌软质引流管放置于大鼠腰椎板切除区域并固定牢靠。治疗后7天内每日收集伤口灌洗液。测定灌洗液中性粒细胞计数及MPO、H2O2、TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β1水平。b)免疫荧光法观察硬膜外纤维化组织中CD31和CD68的表达,用于检测新生血管和巨噬细胞含量。染色后切片使用激光共聚焦显微镜拍照,并测定其面积百分比。6.PXNT防纤维化粘连水凝胶的体内外安全性评价a)PXNT防纤维化粘连水凝胶细胞毒性和体内安全性评价。1.使用MTT法测定不同配方（PXN,PXT,PXNT和PLN）与L929小鼠成纤维细胞共培养5天期间细胞活性的变化。2.术后1月进行静脉血肝肾生化功能分析,ELISA法测定血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。3.H&E染色观察心、肝、脾、肺、肾组织切片。b)PXNT防纤维化粘连水凝胶神经功能安全性评价。1.术后8周对各组大鼠使用BBB运动功能评分量表进行评分。2.术前、术后4周、术后8周,对PXNT治疗大鼠进行运动诱发电位（MEPs）测量。振幅和潜伏期数据进行分析。3.PXNT组的大鼠在术后8周进行髓鞘透射电镜形态学观察。结果1.锥形通道下MIS-TLIF手术的临床结果及术后硬膜外纤维化评价末次随访时,锥形通道下MIS-TLIF手术组获得与开放TLIF组相同的疗效,同时减缓椎旁肌的退变。两个手术组硬膜外纤维化粘连评分无显著性差异。2.PXNT防纤维化粘连水凝胶的筛选和制备a)TPCD NP的制备和表征制得形态规则、较窄粒径分布的抗炎、抗氧化应激的TPCD纳米粒。b)具有生物黏附、抗炎、温敏性防纤维化粘连水凝胶的配方筛选相较于模型组,经1mg/m L和5mg/m L浓度的TPCD NP治疗后,H2O2和IL-6水平显著降低。在0.2mg/mL的低浓度时,H2O2和IL-6的含量与模型组没有显著差异。TGF-β1含量表达只有PX18-NP1凝胶（18wt%PX、1mg/m L TPCD NP）治疗组显著降低。此外,室温下,无论PX的浓度如何,5mg/m L TPCD NP浓度的PX溶液都会发生凝胶转相,遂排除。至此TPCD NP浓度确定为1mg/mL。接下来将鞣酸加入配方,硬膜黏附能力和肌肉黏附能力均随鞣酸浓度的升高而升高。但当鞣酸质量比为3wt%时,凝胶失去温敏转相能力。因此,18wt%PX、1mg/m L TPCD NP、2wt%鞣酸的水凝胶（PXNT）进入下一阶段的表征分析与动物实验。同时,该水凝胶在加入鞣酸后黏附剪切应力提高了4倍左右。3.PXNT防纤维化粘连水凝胶的表征a)PXNT凝胶在室温时呈透明、清亮的淡黄色流体状,在37°C时倾斜小玻瓶凝胶不再发生流动,发生了明显的溶胶-凝胶转换。b)共聚焦显微镜观察显示Cy5标记的TPCD-NP在FITC标记的水凝胶中均匀分布。c)FT-IR光谱分析也证实了不同组分的存在。d)扫描电镜（SEM）观察到的冻干凝胶断裂面中发现了其内部多孔网络状结构。同时,在凝胶样品高放大倍数的表面和断裂面中清晰地发现了嵌入的TPCD纳米粒。e)储能模量（G′）和损耗模量（G″）均随温度升高而增大。随温度进一步升高,G′与G″交会,溶胶-凝胶转变温度为26.9°C,提示PXNT已凝胶化转相。G′在37℃时为3000-3500Pa,与正常脊髓模量值（4000Pa）相近。角频率测试的粘弹性区域内,G″和G′为线性响应,tanδ变化范围为0.48至0.37,表现出典型弹性改变行为。当应变率在1%到60%之间变化时,PXNT是稳定的凝胶状态,可承受人体内最大应变（10%）。在200%的高应变率下,PXNT表现出类流体行为,当应变率降低为2%时,PXNT迅速恢复最初模量,且此过程可重复。粘度随剪切率变化测试显示了PXNT水凝胶的剪切变稀行为,阶梯剪切率变化测试表明,在高剪切和低剪切速率下转换,PXNT可快速自我修复为最初粘度。机制研究表明PXNT水凝胶的剪切变稀和自我修复是由于疏水和氢键作用形成的非共价交联的瞬间断裂引起的。f)在37℃时,PXNT水凝胶在第7天时基本完全水解,而不含鞣酸的PXN水凝胶在3天内完全水解。g)PXNT水凝胶体外释放可持续至第7天,PXN大约在第3天。此释放时间可覆盖硬膜外纤维化形成最关键的第二阶段（术后3-5天）。PXNT水凝胶释放的TPCD NP和新鲜制备的纳米粒粒径分布相似。h)PXNT水凝胶体内残留实验中,Cy7.5标记的PXNT比PXN水凝胶具有更长时间的荧光残留,可维持至第7天,而PXN水凝胶仅维持约3天。TA中酚基基团可作为假交联剂增加水凝胶中组分之间非共价键作用。4.PXNT防纤维化粘连水凝胶在动物腰椎板切除模型中的疗效评价a)小动物核磁共振评估硬膜外纤维化观察中,使用PX、PXT、PL和PLN治疗的大鼠,在术后8周时硬膜后方被钆增强的低密度信号组织覆盖,未发现硬膜与后方组织之间明显分界。PL和PLN比模型组的纤维化程度更重。PXN治疗效果优于上述几组。PXNT治疗组在硬膜周围仅存在非常稀薄的低信号强化边缘,在硬膜上无直接粘连。PXNT治疗组的纤维化面积定量和磁共振纤维化评分结果均为最低。术后8周,大体观察显示使用PX、PL或PLN治疗的大鼠,硬膜周围受到致密性纤维化瘢痕组织的压迫,很难将其与硬膜组织分离。PXN治疗组纤维化瘢痕相对较少,粘连较轻。PXNT组硬膜周围的纤维化组织稀薄、疏松,硬膜外粘连轻微,剥离后不会损伤硬膜,硬膜外纤维化评分最低,仅为1.2±0.4。组织学分析中,模型组椎管外充满大量的胶原和成纤维细胞,且粘连严重。PX、PL或PLN治疗组也发现类似结果。PL和PLN治疗组成纤维细胞含量显著多于其他治疗组。PXN和PXT治疗组成纤维细胞含量略少于上述几组。相比之下,PXNT治疗组显著降低,且硬膜外纤维化评分也是最低。此外,Masson染色显示模型组纤维化组织浓厚、密集。PXN治疗组中硬膜与后方的纤维化组织轻微粘连,粘连部位可见少量的成纤维细胞和稀疏的胶原纤维。PXNT组中硬膜和纤维化瘢痕组织之间有明显的间隙,硬膜外瘢痕最为轻微,纤维化面积百分比最低。PL和PLN组纤维化面积显著高于模型组。PL体内降解为乳酸和乙醇酸,其较长的体内残留时间（>4周）会发生异物反应。b)根据大体观察、磁共振成像、H&E和Masson染色的结果,使用PXNT治疗的大鼠比Interceed组大鼠成纤维细胞浸润和纤维瘢痕组织形成明显更少。组织切片观察PXNT组大鼠在硬膜与后方组织之间间隔更为明显。c)由于硬膜周围纤维状组织稀疏且未完全成熟,PXNT治疗的家兔硬膜更易于分离暴露。然而,模型组瘢痕组织较为致密且粘连形成,分离操作会将硬膜撕裂。PXNT治疗组大体观纤维化评分显著更低。核磁共振图像显示PXNT组的低信号（纤维化瘢痕）区域显著低于模型组。5.PXNT防纤维化粘连水凝胶防治椎板切除后硬膜外纤维化粘连的机制探索7天后,PXNT和PXN治疗组的中性粒细胞和髓过氧化物酶的含量显著低于其余治疗组,尤其是PXNT组。同样,TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平也显著降低。包含TPCD纳米粒的治疗组H2O2水平显著降低。PL和PLN组的炎症反应比其他组更重,甚至是模型组。在所有时间点,PXNT组TGF-β1表达均为最低。术后8周瘢痕组织免疫荧光分析显示,PXNT组巨噬细胞含量最低,新生血管浸润区域显著减少。6.PXNT防纤维化粘连水凝胶的体内外安全性评价细胞毒性实验中PXNT、PXN、PXT、PLN、PL、PX水凝胶均表现出了较低的细胞毒性。术后7天,所有治疗组与模型组白细胞计数趋势相似。术后4周,PXNT组大鼠ALT、AST和CREA水平未显著升高,血清炎性细胞因子没有显著增加。大鼠主要脏器H&E切片未观察到明显损伤和病理变化。PXNT组BBB运动功能评分无明显变化,其余组呈现不同程度的降低,PL和PLN组比模型组更差。运动诱发电位结果显示PXNT水凝胶治疗的大鼠术前、术后4周及术后8周MEPs波形相似。平均潜伏期和振幅统计无显著差异。术后8周髓鞘透射电镜观察中,除PXNT组外,其余组均可见不同程度的髓鞘分层改变。结论微创通道下的MIS-TLIF手术无法减轻硬膜外纤维化粘连。通过三个功能模块的简单组合,设计出具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、生物黏附、自我修复和温敏特性的多功能水凝胶。根据水凝胶的体外性能和体内活性,分级筛选后完成制备。水凝胶表征分别验证了其溶胶-凝胶转相、凝胶中纳米粒形态稳定且均匀分布、流变学性能优异。PXNT水凝胶在椎板切除部位局部治疗后,通过减轻局部炎性水平和氧化应激反应,以及抑制纤维化和新生血管生成,有效防治硬膜外纤维化粘连。该水凝胶具有以下优点:1)使用方便且能胜任微创管道下手术操作,完全覆盖硬膜表面形成有效物理屏障;2)合适的生物黏附能力,避免脊髓自然运动导致的凝胶滑动;3)保证临床效果前提下,合适的体内残留时间,避免长时间残留导致的严重异物反应;4)理想的粘弹性、柔软性,不影响脊髓自然活动且避免可能的神经压迫;5)通过有效的抗氧化应激、抗炎和抗纤维化作用防治硬膜外纤维化;6)良好的生物相容性和神经功能安全性。