一、文献研究本章总结了慢性肾病的定义,慢性肾病的分期、发病原因及临床干预策略;总结了肠源尿毒素硫酸引哚酚(Indoxyl sulfate,IS)、硫酸对甲酚(P-cresyl sulfate,PCS)的来源,理化性质,体内生成与代谢的过程,及其在慢性肾病进展中的作用;系统归纳了黄葵及其组方药物的化学成分及药理作用研究现状,为后期的药效及机制研究提供了理论基础。二、黄葵四物方对肾脏切除慢性肾病模型大鼠肾脏损伤的保护作用及机理研究大鼠5/6肾切除模型因其病理学变化与人类慢性肾病进展高度符合,反映慢性肾功能不全,是目前理想的、采用最广泛的慢性进展性肾病模型。大鼠经5/6肾切除造模后,给予黄葵胶囊或黄葵四物方(1.25g/kg、2.5g/kg、5g/kg),给药8周。在造模与给药的不同时间段,收集大鼠血浆、尿液等样本,应用多功能酶标仪、HPLC-FLU等仪器,测定血肌酐、血尿素氮、24 h尿蛋白排泄量、肾组织病理改变等指标,评价黄葵四物方的药效。结果发现:(1)黄葵四物方能显著降低模型大鼠的24h尿蛋白排泄量,且在给药初期就有显著的降低作用;(2)不同给药剂量的黄葵四物方均能显著降低大鼠血肌酐、血尿素氮的含量。大鼠肾脏组织经HE染色,评价肾组织的炎症细胞浸润程度,结果发现:(3)模型大鼠肾间质出现大量炎症细胞浸润,病理损伤评分接近3分;而黄葵四物方能显著减轻模型大鼠肾间质炎症细胞浸润,在给以黄葵四物方1.25 g/kg时,病理损伤评分接近1分,为轻微损伤;(4)B7-1、WT1、Podocin是肾脏足细胞损伤指标;PAI-1是肾纤维化指标,肾脏损伤后表达增加;WTl、Podocin在正常成熟肾脏足细胞中具有高表达,肾脏损伤后表达降低。黄葵四物方可调控模型大鼠肾脏B7-1、PAI-1、WT1、Podocin的蛋白表达,提示可改善肾脏足细胞损伤、降低肾纤维化程度。综合以上4项指标,证明黄葵四物方药效确切。文献研究发现,慢性肾病患者肠道内出现氨基酸、蛋白质代谢异常,其肠道内的氨基酸水平与健康人群相比有明显异常。为了观察慢性肾病模型大鼠肠道内氨基酸代谢特征,我们使用UPLC-TQ/MS对模型大鼠肠道内氨基酸的含量进行定量测定。结果发现,在造模2周与给药8周的实验周期内,5/6肾切除致肾衰模型大鼠肠道内氨基酸代谢出现显著异常,且呈周期性变化,随着慢性肾病的进展,出现代谢紊乱的氨基酸数量显著增加。造模4周时,空白组与模型组大鼠肠道内氨基酸含量有显著性差异的为色氨酸、酪氨酸;造模6周时,两组大鼠肠道内氨基酸含量有显著性差异的为色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等共6种氨基酸;造模8周时,两组大鼠肠道内氨基酸含量有显著性差异的为色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸,谷氨酸等8种氨基酸;造模10周时,两组大鼠肠道内氨基酸含量有显著性差异的为色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸等9种氨基酸。提示随着慢性肾病的进展,模型组大鼠肠道内氨基酸代谢越发紊乱。肠道中氨基酸是由肠道微生物经各种途径合成,由此我们对两组大鼠不同造模周期粪便中的肠道微生物进行测序,结果发现,随着造模时间的加长,肠道微生物各菌群间的丰度发生了逐步变化,第2周与第10周肠道微生物的丰度变化对比最明显,如 Chlamydiales,Rhodospirillales,Rhodobacterales,Rhizobiales,Xan-thomonadales,Lactobycillales,Legionellales,Rhodocyclales等都属于丰度变化较大的肠道微生物,而这些丰度出现变化的菌群,大多与蛋白质的分解或氨基酸的合成有关。以上结果提示,慢性肾病进展过程中,模型大鼠肠道内菌群丰度及其代谢过程如氨基酸代谢过程发生显著改变。为了寻找黄葵四物方对模型大鼠内源性代谢产物的调控作用,我们基于代谢组学研究策略,使用UPLC-TOF/MS技术,运用MassLynx工作站,定性分析了黄葵四物方对模型大鼠血浆中的差异代谢产物的影响。在空白组与模型组间鉴定出多种差异内源性代谢物,其中,尿毒素类分子硫酸吲哚酚(IS)、硫酸对甲酚(PCS)是空白组与模型组中有显著性差异的代谢物。经半定量分析发现,黄葵四物方可显著降低这两种尿毒素分子含量。在接下来的研究中,我们进一步探讨黄葵四物方对肠源尿毒素IS、PCS及其前体的调控作用,评价黄葵四物方治疗慢性肾病的具体起效机制。我们采用UPLC-TQ/MS及HPLC-FLU对IS、PCS及其前体分子(吲哚、对甲酚)在模型动物体内(血浆、肝脏、肾脏)的含量进行定量分析。结果发现,给药8周后,黄葵四物方在1.25 g/kg的给药剂量下,显著降低血浆中IS、PCS的含量,显著降低IS、PCS在肝脏内的合成,显著降低IS、PCS肾脏内含量;提示黄葵四物方对IS、PCS在肝脏内合成与肾脏转运环节都有显著的抑制作用。同时,黄葵四物方在1.25g/kg的给药剂量下,可显著降低IS、PCS的前体分子吲哚、对甲酚在粪便中含量,在给药4周时,黄葵四物方给药组大鼠粪便中的吲哚、对甲酚含量出现了显著性降低;给药8周时,黄葵四物方给药组对大鼠粪便中吲哚、对甲酚依旧有显著性降低效果,提示黄葵四物方可能通过减少IS、PCS前体分子在肠道内的合成降低体内IS、PCS含量。三、黄葵四物方对模型大鼠的保护作用剂量优化前期研究发现,黄葵四物方在高剂量下(2.5 g/kg,5 g/kg)未显现出更好的药效,在最低给药剂量下(1.25 g/kg)拥有最佳药效,在此剂量下,黄葵四物方可显著减轻5/6肾切除致肾衰模型大鼠肾脏损伤、显著降低模型大鼠24h尿蛋白排泄量等。从而提示黄葵四物方在1.25 g/kg-5g/kg未表现出正向药效剂量依赖关系,给药剂量与药效成反比。为了寻找黄葵四物方的最佳给药剂量,我们以1.25 g/kg为给药高剂量,观察更低剂量下(0.31 g/kg、0.63 g/kg)黄葵四物方的药效。大鼠经5/6肾切除造模后,给以黄葵四物方(低剂量组:0.31 g/kg;中剂量组:0.63 g/kg;高剂量组:1.25 g/kg)治疗8周。期间收集大鼠尿液、血浆等多种样本,对大鼠尿蛋白、血肌酐、血尿素氮、体内IS、PCS等指标进行定量分析,并对肾脏病理切片经由HE、PAS、MASSON染色后进行病理指标评分。结果发现,造模后模型组大鼠出现肾脏病理损伤严重、24h尿蛋白排泄量显著升高等现象;而在1.25g/kg给药剂量治疗下,大鼠24h尿蛋白排泄量显著低于模型组与其他给药剂量组;HE染色显示,模型组大鼠肾脏出现明显器质性病变,肾间质有大量炎症细胞浸润及肾间质纤维化,病变平均评分为2.57,而黄葵四物方给药组在1.25 g/kg的给药剂量下,肾间质有少量炎症细胞浸润,肾间质纤维化面积明显减少,病变平均评分为1.33,而在0.31 g/kg、0.63 g/kg的给药剂量下,病变平均评分分别为2.22、2.00;PAS染色显示,模型大鼠肾小球基底膜增厚,而在1.25 g/kg的给药剂量下,大鼠肾脏肾小球基底膜只出现轻度增厚;MASSON染色显示,模型大鼠出现明显的肾纤维化,肾纤维化面积百分比接近50%,而在1.25 g/kg的给药剂量下,肾纤维化面积百分比只有18%。同时,在1.25 g/kg的给药剂量下,大鼠血肌酐、血尿素氮含量显著降低;对肾脏蛋白中B7-1、PAI-1、WT1、Poodocin的表达在给药剂量为1.25 g/kg时有最佳正向调控;显著降低血浆、肝脏、肾脏中IS、PCS的含量。综合上述数据,提示对于5/6肾切除致肾衰模型大鼠,黄葵四物方在1.25 g/kg的给药剂量下药效最优。腺嘌呤肾衰模型能够很好的模拟人类慢性肾病的发生、发展的病程和特征,其优点在于复制方便、稳定性好、死亡率低、具备多种CKD并发症,临床相似度高,能较好地满足CKD进展机制及其并发症防治研究的需要。为了进一步验证黄葵四物方的药效,选择腺嘌呤肾衰模型,观察黄葵四物方对腺嘌呤模型大鼠的最佳给药剂量。对大鼠进行腺嘌呤灌胃造模后,给以黄葵四物方(低剂量组:0.31 g/kg;中剂量组:0.63 g/kg;高剂量组;1.25 g/kg)治疗8周。期间收集各组大鼠粪便、尿液、血浆等样品。使用酶标仪、HPLC-FLU、UPLC-TQ/MS等仪器对24h尿蛋白,血肌酐、尿素氮等指标进行定量分析,同时并对肾脏病理切片经由HE、PAS、MASSON染色后进行评分。结果显示,黄葵四物方在1.25 g/kg的给药剂量下仍为最佳给药剂量。在此剂量下,大鼠24h尿蛋白排泄量相对于其他给药组,有显著性降低;大鼠肾脏经HE、PAS、MASSON染色后的病理损伤评分也显示在1.25 g/kg时有肾脏损伤程度最低,炎症细胞浸润程度最轻、肾间质纤维化面积最小、肾小球基底膜增厚程度最低;同时对大鼠体内血肌酐、血尿素氮含量有显著降低作用,并对肾脏蛋白中B7-1、PAI-1、WT1、Podocin的表达有最佳正向调控;血浆、肾脏中IS、PCS的含量也为各给药组中最低,与黄葵四物方对5/6肾切除致肾衰模型大鼠的治疗效果基本一致。综合上述数据,提示对于腺嘌呤肾衰模型,黄葵四物方在1.25 g/kg的给药剂量下药效最优。综合上述数据,可以得出以下结论:(1)黄葵四物方药效确切,给药剂量为1.25g/kg时,能显著减少尿蛋白排泄;改善肾脏损伤,减轻肾脏炎症反应,减少肾间质纤维化,降低肾小球基底膜沉积;显著降低大鼠血肌酐、血尿素氮;对肾脏蛋白中足细胞损伤、肾纤维化指标的表达有显著有益调控。(2)黄葵四物方的起效机制可能为通过调控肠源尿毒素IS、PCS前体分子(吲哚、对甲酚)在肠道内的生成环节,以及调控IS、PCS的生成、转运等多个环节,发挥肾脏保护作用。(3)在0.31g/kg,0.63g/kg,1.25g/kg,2.5g/kg,5g/kg五个剂量中,黄葵四物方的最佳给药剂量为1.25 g/kg。