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高压脉冲电场(PEF)技术作为一种新兴的非热加工技术,具有强度高、时间短、温升小、能耗低等特点,在杀菌钝酶、活性物质提取、维持食品新鲜度等方面具有极大的优势,已成为各国食品研究与开发的热点之一。近年来,人们在应用PEF技术钝化酶过程中发现,一些较低强度的PEF处理条件能迅速地提高酶的活性。但目前这些激活研究大多集中于对酶活性的影响,对其性质及构象影响报道较少,且研究层面也不够深入。为寻求高效、安全、快捷地运用PEF对酶进行活化改性的可行性。本论文拟以食品工业需求广泛的三种糖酶—α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和果胶酶为研究对象,采用PEF对其活化处理,系统地研究PEF对α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和果胶酶活化效果、酶学性质、动力学热力学参数及酶结构等方面的影响。主要的研究结果如下:(1)α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、果胶酶的最佳PEF处理条件为:15 k V/cm,100mL·min-1;15 k V/cm,80 m L·min-1;12 k V/cm,80 mL·min-1(电场强度,流速)。在此条件下,目标酶活性分别增加22.13±1.14%、20.74±0.71%和21.89±1.67%,PEF激活效果为α-淀粉酶>果胶酶>葡萄糖淀粉酶。这种激活效应在4℃环境下保存稳定性葡萄糖淀粉酶>果胶酶>α-淀粉酶,保存时间分别为23 h、19 h和18 h。(2)PEF处理使α-淀粉酶最适温度范围由55-60℃拓宽为50-60℃,且在65℃和70℃下的催化效率显著高于未处理对照组。葡萄糖淀粉酶和果胶酶最适温度范围分别由65-70℃、50-55℃拓宽至60-70℃、45-55℃,二者在低于其最适温度的温度范围内催化效率显著高于未处理对照组。但PEF处理并未改变α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和果胶酶的最适反应pH及最适pH范围,PEF处理后目标酶的最适pH分别为6.0、4.5和3.5,最适pH范围分别为5.5-6.5,3.5-5.0和3.5-4.0,与未处理的对照组一致。(3)酶促动力学研究显示PEF处理使α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、果胶酶Km降低,Vmax增大,表明目标酶经PEF处理后与底物的亲和力增加,其在饱和浓度下的限制反应速率增大。同时,表征催化效率的催化常数(kcat)和二级速率常数(kcat/Km)增大,表明目标酶经PEF处理后催化效率增大,且催化效率增幅为α-淀粉酶>果胶酶>葡萄糖淀粉酶。(4)酶热力学研究显示α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、果胶酶经PEF处理后热失活速率常数k降低,半衰期t1/2延长,这表明PEF使酶分子的热稳定性得到有效的提高,对降低热失活有显著的作用,且在本实验条件下以α-淀粉酶稳定性提高最为显著。酶反应的活化能Ea、热焓ΔH及熵ΔS经PEF处理后均明显降低,自由能ΔG升高,表明PEF处理使目标酶催化水解反应更容易发生且有利于目标酶的热稳定,该作用对目标酶稳定性提高作用α-淀粉酶>果胶酶>葡萄糖淀粉酶。(5)SDS-PAGE结果表明PEF处理不改变α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、果胶酶电泳谱带,未引起肽键断裂,没有产生新的亚基。(6)CD光谱结果表明,PEF处理使α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、果胶酶α-螺旋分别增加34.76%、25.86%和10.28%,无规则卷曲含量分别降低12.04%、8.24%、17.8%。在本实验条件下,根据无规卷曲的降低量推测PEF处理酶有序化程度为果胶酶>α-淀粉酶>葡萄糖淀粉酶,其二级结构改变。(7)内源荧光分析显示PEF处理使酶吸收峰增强,荧光强度增加幅度α-淀粉酶>葡萄糖淀粉酶>果胶酶,表明更多Trp等芳香族氨基酸残基暴露,从而使荧光强度增强,其三级结构发生变化。这些结构变化使酶分子更为有序,从而使酶活性提高。