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血吸虫病(Schistosomasis)仍然是一种流行于世界范围内的严重影响人类公共健康的寄生虫疾病,感染人数多达2亿,主要流行区在70多个发展中国家。血吸虫分为很多种类,在我国主要流行的是日本血吸虫。血吸虫病是一种人兽共患性寄生虫病,钉螺是其中间宿主,人是终宿主。血吸虫对人的危害主要在于成虫能在肝脏中不断产生虫卵,引起炎性免疫反应,导致肝脏肉芽肿的形成和纤维化的改变,最后发展为肝硬化。日本血吸虫感染所带来的危害逐渐被人们认识,各种预防措施和化疗逐渐应用到疫区。越来越来的项目研究立足于抑制虫卵的产生和血吸虫感染的预防。目前对于血吸虫病的治疗仍以药物吡喹酮化疗为首要选择。但这种药物治疗存在明显的局限性,虫体被杀死后释放出大量的抗原物质,易引起过敏反应,而且该类药物还存在一系列严重毒副反应,另据报道,在非洲已发现耐吡喹酮虫株。因此,寻求新的药物治疗靶标及新的治疗手段仍是血吸虫病治疗的重要研究任务。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是儿茶酚胺(Catecholamine,CA)类物质合成过程中的限速酶, TH通过复杂的调节过程催化酪氨酸产生多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素等儿茶酚胺类物质,调节血吸虫虫体肌肉的活动度及成虫的产卵率。而Sj14-3-3参与调节TH的活化过程。这些特点使得这两个酶成为备受关注的药物治疗靶点。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi提供了一种快捷、高效的抑制特异性基因表达的技术手段,有助于研究该基因在生物模型系统中的作用,是研究基因功能的重要工具之一。该技术已从线虫的研究拓展到包括血吸虫等各种生物。对于低等生物,RNA干扰始于长片段dsRNA的降解,直接转染长片段dsRNA就可以特异抑制目的基因的表达。这种长片段的dsRNA是否能在日本血吸虫体内抑制目的基因的表达?抑制SjTH这种关键酶是否能有效影响日本血吸虫的活力?Sj14-3-3能否通过与SjTH的相互作用影响其酶活性,干扰儿茶酚胺代谢?尚未见文献报道。本研究以儿茶酚胺类合成途径中的关键酶—TH和调控蛋白—14-3-3编码基因为靶标,采用体外转录长片段dsRNA分子转染日本血吸虫尾蚴。根据SjTH和Sj14-3-3基因转录表达结果,阐明长片段dsRNA对日本血吸虫体内基因表达的影响。在此基础上,观察对日本血吸虫尾蚴虫体的活力抑制情况及其对小鼠的感染能力和感染小鼠的肝脏肉芽肿形成情况,进一步探讨SjTH和Sj14-3-3在日本血吸虫病防治过程中的作用,为开发新的抗日本血吸虫药物及新的治疗方法奠定基础。1.长片段dsRNA在日本血吸虫体内对目的基因的抑制RT-PCR检测SjTH dsRNA处理的日本血吸虫尾蚴体内SjTH mRNA的相对表达水平,内参基因采用SjGAPDH基因。不同组别SjTH mRNA的相对值计算用SjTH(灰度值)/GAPDH(灰度值)所得值绘成的直方图来表示。在感染第3d和第4d后,SjTH dsRNA处理组的SjTH mRNA与对照组相比分别下降了58%和85%,与对照组相比较差异有显著性(P<0.05);Sj14-3-3 dsRNA处理组SjTH mRNA与对照组相比分别下降了30%和49%;LacZ dsRNA处理组在转染dsRNA 3d和4d后,与对照组相比差异无显著性。Sj14-3-3 dsRNA转染后对Sj14-3-3 mRNA水平影响的规律与SjTH dsRNA对相应mRNA的影响相似。RT-PCR检测Sj14-3-3 dsRNA处理的日本血吸虫尾蚴体内Sj14-3-3 mRNA的相对表达水平,内参基因采用SjGAPDH基因。不同组别Sj14-3-3 mRNA的相对值计算用Sj14-3-3(灰度值)/GAPDH(灰度值)所得值绘成的直方图来表示。在感染第3d和第4d后,Sj14-3-3 dsRNA处理组的Sj14-3-3 mRNA与对照组相比分别下降了62%和81%;SjTH dsRNA和LacZ dsRNA处理组在转染dsRNA 3d和4d后,与对照组相比差异无显著性。Western blotting检测各处理组对SjTH蛋白的影响,也从蛋白水平近一步验证了RT-PCR的结果。2.长链Sj14-3-3 dsRNA对日本血吸虫尾蚴体内SjTH mRNA的影响Sj14-3-3 dsRNA转染24h和72h后,日本血吸虫尾蚴体内SjTH mRNA的量与空白对照组相比没有明显减少。但在转染96h后,SjTH mRNA的量明显的下降,约降低了49%,与空白组相比差异有显著性(P<0.05)。3.长链dsRNA抑制Sj14-3-3与SjTH后对日本血吸虫的感染能力的影响将24只小鼠随机分成4组,每组6只。阴性对照组:正常小鼠;阳性对照组:尾蚴感染小鼠;SjTH dsRNA处理组:用SjTH dsRNA处理尾蚴1天后感染小鼠;Sj14-3-3 dsRNA处理组:用Sj14-3-3 dsRNA处理尾蚴1天后感染小鼠。感染9周后,取出小鼠的肝脏进行病理切片,在显微镜下观察发现:阳性对照组肝脏有明显的肉芽肿和纤维化病变, SjTH dsRNA处理组和Sj14-3-3 dsRNA组的肝脏肉芽肿和纤维化病变很轻,小鼠在感染后活力没有变化。综上多述,我们得出以下结论:(1)体外转录长链dsRNA在日本血吸虫尾蚴体内能抑制目的基因的表达;(2)儿茶酚胺合成过程中的关键酶—TH和调节蛋白—14-3-3被体外转录长链dsRNA抑制后,日本血吸虫尾蚴的活力显著下降;(3)经dsRNA处理的尾蚴感染小鼠后,小鼠的肝脏损伤情况要明显减轻,肉芽肿明显减少,推测SjTH表达变化可能与血吸虫成虫产卵有相关性。