基于膜片钳技术的洋葱铝胁迫及缓解效应研究

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目前,土壤酸化所引发的铝毒问题是全球关注的环境科学热点。大多生长在酸性土壤中的植物往往会发生铝中毒,并间接影响植物对水分与营养成分的吸收,导致农作物产量下降,因此铝毒被认为是一个世界性的限制酸性土壤上作物产量的主要因子。K+是植物细胞中含量最为丰富的阳离子,也是植物生长发育所必需的唯一的一价阳离子,它在植物生长发育过程中起着重要的作用,具有重要的生理功能。铝毒抑制根系对K+的吸收,降低植物根系和地上部钾的含量,Al3+是阳离子通道阻断剂,可阻断小麦根细胞的K+和Ca2+通道,长时间阻断K+通道,会导致地上部出现缺钾症状。本文利用膜片钳全细胞记录方式研究了细胞内外不同浓度铝对洋葱内表皮细胞质膜上内向K+通道电流的影响,以探讨铝对植物的作用机理,并研究钙对铝胁迫的缓解效应,根据不同浓度钙对内向K+电流促进率的不同,建立缓解模型—Al-Ca浓度关系模型,为宏观精确施用钙肥提供一定的参考。实验主要结果如下:(1)优选洋葱原生质体的制备条件。通过酶解法降解细胞壁释放出原生质体,利用离心从粗提取液中纯化出原生质体,并通过血球计数板计数来比较制备的效果。结果表明:酶解时间、pH、渗透压稳定剂(甘露醇)及酶的种类是影响原生质体制备的重要因素。又采用正交试验设计,得到制备洋葱原生质体的最佳条件:用1.5%纤维素酶、0.1%果胶酶和0.1%BSA配成酶解液,调节pH为5.5,加入0.6mol/L甘露醇,将酶液在28℃条件下保温处理2.0小时。(2)用全细胞膜片钳技术研究洋葱原生质体的内向K+电流。所观察到的电流特性和其他作物中的内向整流K+通道中的电流特性相类似,并发现低浓度的AlCl3促进了内向K+电流,当电压为最大负值时,相对于低浓度,高浓度的AlCl3抑制了内向K+电流。(3)本文实验发现,细胞内和细胞外的AlCl3对内向K+电流都有明显的抑制作用,且呈一定的浓度依赖性,这一结果表明AlCl3对洋葱内表皮细胞K+通道有抑制作用。全细胞记录显示细胞内外的Al3+对内向K+电流的阻断常数Ki不同。细胞外Al3+对内向K+电流的阻断常数Ki为59.65μmol/L,细胞内Al3+对内向K+电流的阻断常数Ki为1.85×10-8mol/L。可见Al(3+)在细胞内比细胞外对内向K+电流产生更强的抑制作用,也说明在洋葱内表皮细胞质膜内向K+通道上细胞膜内侧比外侧存在更强的Al3+结合位点。因此我们认为铝主要通过对内向K+通道的内部阻断来抑制K+的吸收。(4)通过测量胞外不同Al3+和Ca(2+)浓度组合且同一刺激电K+压下的电流值,计算Ca2+对K+电流的促进率,并以此为桥梁(促进率在三倍以上),建立了Al-Ca浓度关系模型。给出了求解有效缓解不同Al3+浓度胁迫所需的Ca2+浓度值的方法,包括Ca2+浓度最大值[Ca2+]max、最小值[Ca2+]min和最优值[Ca(2+]optimal分别与Al3+浓度关系曲线图以及拟合方程。模型的建立给实际应用中向酸性土壤溶液中施加含钙改良剂缓解铝胁迫以及精确施肥提供了一定理论依据和数据参考,对离子通道水平农作物的抗铝胁迫机制研究有重要的学术价值。
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