恶性肿瘤的靶向治疗,在非手术治疗的手段中,是实现精准、安全、有效治疗的关键。目前的靶向治疗通常以化学的方法将载体与药物结合的递送方式居多,这种方式在体内存在着不稳定及靶向性差等问题。聚焦超声消融手术(Focused Ultrasound Ablation Surgery,FUAS)或高强度聚焦超声(High intensity focused ultrasound,HIFU)是一种物理治疗肿瘤的方法,是实体肿瘤的微无创治疗手段。但在治疗过程中,随着超声波传播距离的增加,其能量衰减严重,导致治疗大体积或深部肿瘤时,治疗效率降低,容易出现并发症或副作用。为此,针对HIFU治疗增效剂的研究应运而生。课题组前期的研究将具有喜好厌氧环境的双歧杆菌作为寻靶肿瘤的载体,与HIFU增效的物质结合递送入肿瘤,并取得了一定进展,开启了生物靶向递送HIFU增效物质的新尝试。现有的问题是,电转化法至今未成功将增效剂转入双歧杆菌中;化学键连接法的连接成功率较低且只能用于先体外连接再递送的方式;而阳离子连接法虽然连接成功率较高,但是在体内实验中稳定较差,且部分研究认为阳离子存在生物毒副作用的弊端。另外,由于复杂的肿瘤微环境,包括缺氧和低p H值等因素降低了双歧杆菌荷载的HIFU增效物质进入肿瘤的效率,从而加大了对肿瘤的靶向治疗的难度,所以选择合适的递送方式尤为重要。为此,本研究试图通过双歧杆菌-链霉亲合素化双歧杆菌抗体-包裹全氟己烷的生物素化脂质纳米粒的连接方法,制备一种新型生物靶向性HIFU增效剂,并针对该增效剂不同递送方式对纳米粒在肿瘤中的滞留、HIFU增效及机制等方面展开讨论。目的:探究双歧杆菌联合脂质纳米粒不同递送方式对HIFU治疗实体肿瘤的增效作用。方法:1.制备包裹全氟己烷的生物素化脂质纳米粒(biotinylated lipid nanoparticles coated with perfluorohexane,PFH/BL-NPs),光学电镜、透射电镜(TEM)和激光共聚焦显微镜(CLSM)观察其形态及分布。并检测其粒径、表面电位,及PFH包封率。2.验证长双歧杆菌(Bifidobacterium longum,B.longum)的肿瘤靶向性:将20只瘤兔随机分为B.longum组和PBS组,每组10只。观察两组肿瘤及重要脏器组织匀浆后培养皿内菌落的生长情况。3.验证链霉亲合素化长双歧杆菌抗体(Streptavidinated Bifidobacterium longum antibody,SBA)+PFH/BL-NPs复合物的生物安全性:(1)正常兔注射SBA+PFH/BL-NPs复合物,在注射前、注射后1d、3d、7d、14d收集血液样品送生化分析。(2)SBA+PFH/BL-NPs复合物与人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共同孵育后通过CCK-8检测法检测细胞存活率。4.B.longum与PFH/BL-NPs的体外连接:(1)CLSM观察连接情况:将实验分为对照组和实验组,两组均加入等量B.longum,对照组直接加入PFH/BL-NPs,实验组加入等量SBA+PFH/BL-NPs复合物,然后用CLSM观察其连接情况。(2)流式细胞仪检测连接率:将实验分为B.longum组、B.longum+PFH/BL-NPs组、B.longum+SBA+PFH/BL-NPs组,用流式细胞仪检测每组的连接率。5.不同递送方式对PFH/BL-NPs在体内肿瘤靶向性及肿瘤内滞留的影响:(1)小动物活体荧光实验:42只VX2瘤兔被随机分为(B.longum+SBA+PFH/BL-NPs)组和B.longum+(SBA+PFH/BL-NPs)组,每组21只。(B.longum+SBA+PFH/BL-NPs)组的瘤兔直接递送B.longum+SBA+PFH/BL-NPs复合物,B.longum+(SBA+PFH/BL-NPs)组的瘤兔先注射B.longum,7天后注射SBA+PFH/BL-NPs复合物。在不同时间点(注射前、注射后2h、12h、24h、48h、72h、96h)将兔子处死,取出肿瘤及重要器官立刻进行小动物活体荧光检查,测定肿瘤及重要脏器的荧光强度。(2)肿瘤冰冻切片:18只VX2瘤兔被随机分为PFH/BL-NPs组、(B.longum+SBA+PFH/BL-NPs)组、B.longum+(SBA+PFH/BL-NPs)组,每组6只。注射后48h将肿瘤制备冰冻切片并用DAPI进行染色,最后用CLSM进行观察肿瘤中的PFH/BL-NPs的滞留量。6.不同递送方式增效HIFU的实验:将50只VX2瘤兔随机分为5组,设置PBS组、B.longum组、PFH/BL-NPs组、(B.longum+SBA+PFH/BL-NPs)组及B.longum+(SBA+PFH/BL-NPs)组,每组10只。通过250w 5s的HIFU剂量在相同的条件下对VX2瘤兔肿瘤组织行HIFU辐照,观察消融即刻肿瘤组织灰度变化。24h后计算比较肿瘤组织凝固性坏死体积,并通过肿瘤H&E组织免疫染色、HIFU治疗后瘤兔肿瘤体积和体重变化综合评价疗效。7.双歧杆菌影响肿瘤乏氧因子表达:将18只VX2荷瘤兔随机分为B.longum组和PBS组,每组9只。B.longum组中的每只兔子注射2ml B.longum,PBS组中的每只兔子注射2ml PBS。观察注射后第1、3、7天肿瘤切片的免疫组织化学染色,比较缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在其中的表达。结果:1.包裹PFH的生物素化脂质纳米粒(PFH/BL-NPs)外观呈乳白色悬液,CLSM和TEM下观察呈分布均匀的球形。PFH/BL-NPs的粒径分布范围是364.4±53.49nm(PDI=0.113),表面电位为-23.1±5.46m V。PFH包封率为44.45±1.27%。2.长双歧杆菌的肿瘤靶向性:长双歧杆菌菌落只出现在B.longum组的肿瘤培养皿中,表明长双歧杆菌仅在肿瘤中定殖。3.SBA+PFH/BL-NPs复合物的生物安全性:(1)血常规及血生化指标在注射前后无明显变化(P>0.05)。(2)CCK-8检测法检测细胞存活率都在85%以上,未观察到明显的细胞毒性。4.B.longum与PFH/BL-NPs体外连接:CLSM显示B.longum+(SBA+PFH/BL-NPs)组中B.longum与PFH/BL-NPs呈团聚样连接,且稳定性及实验重复性良好。而B.longum+PFH/BL-NPs组并未观察到有效连接。流式细胞仪显示实验组连接率为84±6.23%,与空白对照组及阴性对照组均有差异,并且有统计学意义(P<0.05)。比较B.longum与PFH/BL-NPs连接前后的生长曲线,两者未见明显差异。5.不同递送方式对PFH/BL-NPs肿瘤靶向性及肿瘤内滞留的影响:(1)小动物活体荧光实验显示两组VX2瘤兔的肿瘤区域均可观察到红色荧光,且两组在48h达到最高荧光强度,但是B.longum+(SBA+PFH/BL-NPs)组的肿瘤区域的红色荧光强度大于(B.longum+SBA+PFH/BL-NPs)组(P<0.05)。(2)肿瘤冰冻切片结果显示,在PFH/BL-NPs组的肿瘤冷冻切片中观察到少量的PFH/BL-NPs。而(B.longum+SBA+PFH/BL-NPs)组肿瘤内滞留PFH/BL-NPs较PFH/BL-NPs组多。但与前两组相比,B.longum+(SBA+PFH/BL-NPs)组里滞留的PFH/BL-NPs最多。6.不同递送方式增效HIFU的实验:B.longum+(SBA+PFH/BL-NPs)组肿瘤的凝固性坏死体积和辐照前后灰度变化值在所有组中最大(P<0.05)。H&E组织免疫结果显示肿瘤中的大量凝固性坏死与正常组织有清晰的边界,而重要脏器则无明显变化,且B.longum+(SBA+PFH/BL-NPs)组肿瘤的凝固性坏死最明显。HIFU治疗后B.longum+(SBA+PFH/BL-NPs)组肿瘤缩小最明显(P<0.05),而瘤兔体重无明显变化。7.双歧杆菌影响肿瘤乏氧因子表达:注射3天后,B.longum组的HIF-1α表达开始低于PBS组,且有统计学意义(p<0.05)。注射后7天,B.longum组肿瘤中HIF-1α的表达降低更明显(p<0.05)。结论:本研究成功制备的PFH/BL-NPs,PFH/BL-NPs和B.longum能通过生物素-亲合素连接法的在体外有效连接,而且具有良好的生物安全性和稳定性。并成功验证了B.longum的肿瘤靶向性。分次递送B.longum和SBA+PFH/BL-NPs复合物的方式较直接递送B.longum+SBA+PFH/BL-NPs复合物能让肿瘤中的PFH/BL-NPs滞留量更多,更能增强HIFU的治疗效率。而B.longum能使肿瘤中HIF-1α的表达减少,改善肿瘤乏氧微环境可能是形成该结果的原因。