【摘 要】
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研究目的:筛选获得具有抗氧化损伤作用的活性分子,并利用现代分子生物学技术手段探讨其作用机制,为临床探索有效的抗氧化药物提供理论依据及实验基础。内容与方法:600μM H2O
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研究目的:筛选获得具有抗氧化损伤作用的活性分子,并利用现代分子生物学技术手段探讨其作用机制,为临床探索有效的抗氧化药物提供理论依据及实验基础。内容与方法:600μM H2O2损伤人正常皮肤永生化角质形成细胞HaCaT 2小时,建立氧化损伤模型,筛选具有抗氧化作用的倍半萜醌类化合物;CCK-8法检测细胞活力,以评价化合物的细胞保护作用;DCFH-DA荧光探针检测化合物对H2O2诱导的胞内ROS含量的影响;化合物处理后,测定胞内GSH水平,采用qPCR及WB检测ho-1、nqo1、akr1c1、gclc、nrf2等基因表达水平,HO-1和Nrf2的蛋白表达差异,并结合IF评价核转录因子Nrf2的激活情况;双荧光酶素报告基因实验评价ARE活性;沉默nrf2基因,检测胞内ARE活性及HO-1蛋白表达变化;WB进一步分析胞内AMPKα、ERK、JNK及p38的磷酸化水平及其与Nrf2-ARE通路的相关性;HO-1抑制剂,AMPKα及ERK磷酸化抑制剂预处理细胞,评价化合物抗H2O2损伤保护作用。实验结果:1.筛选得到两种具有抗H2O2损伤的活性分子,Dysidaminone H（DA8）及3’-methylamino-avarone（DA14）,简称DAs。2.DAs可降低H2O2诱导的HaCaT胞内ROS积聚,上调谷胱甘肽水平。3.DAs可增加Nrf2表达及核内积累,激活ARE,上调HO-1及其它保护性蛋白酶表达。4.沉默Nrf2,DAs诱导的ARE的激活及HO-1表达增加受到抑制。5.HO-1抑制剂明显地减弱DAs的细胞保护作用。6.DAs促进AMPKα和ERK的磷酸化水平。7.AMPKα和ERK的磷酸化抑制剂取消DAs诱导的ARE的激活,HO-1表达上调以及DAs的细胞保护作用。课题结论:获得两种倍半萜醌类活性分子,它们可通过促进AMPKα和ERK磷酸化水平,激活Nrf2-ARE抗氧化信号通路,从而抗H2O2造成的细胞损伤,起保护细胞作用,有望成为治疗氧化应激相关疾病的候选药物。
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