论文部分内容阅读
菊糖果糖转移酶能够催化菊糖产生功能性寡糖双果糖酐III。本课题从酶反应动力学、酶构象及酶催化活力等方面分析了高静压加工对菊糖果糖转移酶催化反应的影响及机制，同时研究了压力及多羟基醇对酶稳定性的影响。首先确立了适于高静压加工的菊糖果糖转移酶催化反应体系（菊糖浓度5%+加酶量3U/g菊糖+醋酸钠缓冲液100mmol/L pH5.5）。体系环境（温度T、压力P及pH）对该酶催化反应影响的研究结果表明：当P≤200MPa，T≤60℃时，压力与温度协同促进该酶反应；当P≤200MPa，T＞60℃时，压力可抵抗酶的热失活，促进酶催化反应进行；200MPa/80℃的条件最有利于该酶催化反应的进行；200MPa/80℃条件下的酶反应最适pH较常压的向碱性方向偏移了1.0个单位。其次，酶反应动力学及活化体积的研究表明：与常压相比，200MPa处理使菊糖果糖转移酶对菊糖的表观Km在60℃时减小了0.08mmol/L，80℃时减小了0.21mmol/L；在相同条件下，60℃时Vm增大了0.14μmol/(mL·min)，80℃时增大了0.38μmol/(mL·min)；同时kcat也增大（60℃时增大了543/s，80℃时增大了1465/s）；在80oC/0.1MPa~200MPa条件下IFTase的活化体积△V≠为负值，在80℃/250MPa~400MPa条件下的活化体积△V≠为正值。再次，采用圆二色谱和内源荧光光谱研究高静压处理前后菊糖果糖转移酶构象的变化，并分析酶构象变化与酶活力大小之间的关系，结果表明：菊糖果糖转移酶的内源荧光主要来自Trp残基，高静压处理后其相对荧光强度和相对酶活力均在200MPa-30min处理后达最高，且两者呈正线性相关，可知酶活力变化与压力引起的Trp微环境的变化有一定关系；圆二色谱的结果显示该酶仅在219nm有负峰，表明β-折叠为菊糖果糖转移酶的主要二级结构；经高静压(100MPa~400MPa)处理后，219nm负峰的峰值大小与相对酶活力呈负线性相关，由此可知β-折叠可能是该酶发挥催化活力的结构基础。最后，酶稳定性的研究表明：在80℃条件下，较低的压力(100MPa~200MPa)可明显增强该酶的稳定性，保压4h后相对残留酶活较常压的高80%；多羟基醇也可增强该酶的稳定性，其中3mol/L山梨醇的稳定作用较好，80℃保温4h后相对残留酶活较未添加山梨醇的高14.08%，比较可知添加多羟基醇对该酶的稳定效果远不如高静压加工。另外，酶催化反应进程的研究表明压力(200MPa)和山梨醇(3mol/L)能协同促进酶反应进行。